【摘要】：抑郁癥是目前全球范圍內最常見的情感障礙類精神疾病,是世界范圍內導致殘疾的最大原因。在過去的十年間,全球范圍內抑郁癥的患病人數逐年增加,且每年因抑郁癥自殺的患者就有80萬人,給當今社會的發(fā)展帶來巨大的負擔。迄今為止,關于抑郁癥發(fā)病機制的學說眾說紛紜,臨床上用于治療抑郁癥的藥物也都以單胺類神經遞質為主要靶點,如選擇性5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)再攝取抑制劑和5-HT受體轉運抑制劑等。盡管此類藥物已在臨床廣泛應用60余載,但其中多數藥物存在起效慢、治療范圍窄,療效差等問題,對眾多的重度抑郁癥患者治療無效。因此,尋求抑郁治療的高效新靶點已迫在眉睫。研究報道,抑郁癥患者前額葉-邊緣系統(tǒng)顯現(xiàn)出葡萄糖低代謝的特征,且抑郁癥患者也比正常人更易患有代謝綜合征;而代謝綜合征患者罹患抑郁癥的風險則比正常人高。因此,有科學家提出“抑郁癥是Ⅱ型代謝綜合征”。研究顯示,抑郁癥和代謝綜合征之間有多種共同的病理特征和發(fā)病機制,如慢性炎癥反應等。在中樞神經系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)中,激活小膠質細胞、星形膠質細胞或者其他髓細胞能誘導神經炎癥的發(fā)生,從而促進炎癥細胞因子、趨化因子以及其他炎癥介質的合成與釋放,最終加重神經損傷。一般認為,激活的小膠質細胞分為M1和M2兩種極化形態(tài),不同極化狀態(tài)下的小膠質細胞呈現(xiàn)的生理功能具有明顯差異。因此,研究抑郁癥病理變化下的小膠質細胞M1/M2型轉化有助于進一步探討抑郁癥發(fā)病的分子機制,以及探尋抑郁癥治療的新策略。過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)屬于核激素受體家族的配體激活轉錄因子,參與糖脂質代謝、細胞分化以及炎癥反應等。愈來愈多的研究表明,PPARs在多種神經系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要的神經保護作用。例如,PPARα/γ雙重拮抗劑能抑制小鼠腦內的炎癥反應從而減輕缺血復灌誘導的腦損傷;PPARβ/δ激動劑能抑制實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦內小膠質細胞活化、減輕病理損傷以及降低死亡率等。這些研究提示,PPARs可能在抑郁癥病理過程中同樣扮演著重要的調控作用。文獻報道,PPARγ激動藥羅格列酮可改善慢性溫和不可預知應激(Chronic mild unpredictable stress,CMS)誘導的小鼠抑郁樣行為,但其具體的作用機制尚不明確。PPARβ/δ是腦內表達最豐富的PPARs家族受體,而有關其在腦內作用的研究卻少有報道。因此,本論文工作擬研究PPARs介導的抗抑郁效應及其作用機制亟需進一步深入研究和探討,從而為基于“非單胺類”抗抑郁新藥的研發(fā)提供新的思路�；趯嶒炇业那捌诠ぷ骰A,本文第一部分主要研究PPARβ/δ在抑郁癥病理進程中對星形膠質細胞的調控作用及機制。建立CMS所致C57BL/6小鼠抑郁癥動物模型,通過行為學、免疫組織化學以及透射電子顯微鏡等方法進行觀察和檢測,從整體水平評價激活PPARβ/δ改善CMS誘導的小鼠抑郁樣行為的作用,以及對腦內海馬神經元以及星形膠質細胞的保護作用;應用皮質酮刺激原代培養(yǎng)的星形膠質細胞建立體外應激模型,進一步研究激活PPARβ/δ介導的星形膠質細胞的保護作用及分子機制。本文第二部分主要研究PPARγ在抑郁癥病理進程中對小膠質細胞表型轉化的調控作用及機制。該部分工作應用脂多糖(Lipopolysaccharid,LPS)刺激原代的小膠質細胞建立體外神經炎癥模型,觀察PPARγ對小膠質細胞表型轉化的影響。研究結果顯示,拮抗PPARγ可誘導M1型小膠質細胞向M2型極化,該作用依賴于LKB1-AMPK信號通路的激活。第一部分激活PPARβ/δ對慢性溫和不可預知應激所致抑郁癥小鼠的治療作用及機制目的:研究并闡明激活PPARβ/δ對CMS所致抑郁癥小鼠的治療作用及機制,為探尋抑郁癥治療的新策略和開發(fā)新型高效抗抑郁藥物提供實驗依據,以拓寬PPARβ/δ的藥理學作用。方法:1.應用野生型C57BL/6小鼠建立CMS抑郁癥動物模型;2.應用糖水偏愛試驗、強迫游泳試驗、曠場試驗和懸尾試驗進行行為學檢測;3.應用免疫熒光技術觀察海馬腦區(qū)神經元和星形膠質細胞的數量、形態(tài)以及相關蛋白的表達情況;4.應用透射電子顯微鏡觀察星形膠質細胞內質網的結構和形態(tài)變化;5.培養(yǎng)原代的星形膠質細胞,采用免疫熒光染色結合體視學計數法,鑒定原代星形膠質細胞的純度;6.應用皮質酮(Corticosterone,Cort)刺激星形膠質細胞,建立體外應激模型;7.應用四甲基偶氮唑鹽(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試驗,觀察激活PPARβ/δ對皮質酮所致星形膠質細胞損傷的影響,并確定治療的有效濃度;8.應用流式細胞術(Flow cytometry,FCM),觀察激活PPARβ/δ對皮質酮所致星形膠質細胞凋亡的影響;9.應用蛋白免疫印跡(Western blotting,WB)法檢測內質網相關蛋白以及內質網應激介導的凋亡通路相關蛋白的表達,觀察激活PPARβ/δ對皮質酮誘導星形膠質細胞內質網應激及凋亡的影響;10.應用免疫共沉淀技術,觀察激活PPARβ/δ對GRP78和p-IRE1α蛋白結合能力的影響。結果:1.PPARs三種亞型在抑郁癥模型小鼠海馬腦區(qū)的表達下調;2.激活PPARβ/δ可顯著改善抑郁癥模型小鼠的抑郁樣行為;3.抑郁癥模型小鼠海馬腦區(qū)尼氏小體形態(tài)和數量未發(fā)生變化;4.激活PPARβ/δ可抑制抑郁癥模型小鼠海馬腦區(qū)星形膠質細胞的內質網應激和損傷;5.激活PPARβ/δ可抑制皮質酮所致原代培養(yǎng)的星形膠質細胞內質網應激和損傷;6.激活PPARβ/δ可促進星形膠質細胞內GRP78與p-IRE1α的結合,并抑制內質網應激的IRE1α通過介導的星形膠質細胞凋亡途徑。結論:1.激活PPARβ/δ可改善CMS模型小鼠的抑郁樣癥狀,對海馬腦區(qū)星形膠質細胞發(fā)揮保護作用;2.激活PPARβ/δ通過抑制星形膠質細胞內質網應激的IRE1α通路介導的凋亡途徑,從而發(fā)揮對星形膠質細胞的保護作用。第二部分拮抗PPARγ通過促進LKB1-AMPK信號通路依賴性自噬而誘導小膠質細胞M1-M2型轉化目的:研究并闡明拮抗PPARγ調節(jié)小膠質細胞轉化的新作用及機制,為神經炎癥相關的疾病提供潛在有效的治療策略,同時為臨床的抗抑郁治療提供新的理論依據。方法:1.培養(yǎng)原代的小膠質細胞,應用免疫熒光染色結合體視學計數法,鑒定原代小膠質細胞的純度;2.應用LPS刺激小膠質細胞,建立體外神經炎癥模型;3.應用普通顯微鏡觀察拮抗PPARγ對LPS誘導小膠質細胞阿米巴樣狀態(tài)的影響,并確定藥物有效濃度;4.應用實時定量聚合酶鏈反應(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)觀察激活PPARγ和拮抗PPARγ分別對LPS刺激后小膠質細胞M1型和M2型標記物表達的影響;5.應用免疫熒光共定位法觀察拮抗PPARγ對LPS刺激后小膠質細胞M1型和M2型標記物表達的影響;6.應用FCM法觀察拮抗PPARγ對LPS刺激后小膠質細胞M1型和M2型標記物表達的影響;7.應用WB法檢測自噬相關蛋白以及自噬上游相關調控蛋白的表達,觀察拮抗PPARγ對LPS刺激后小膠質細胞內自噬水平的影響;8.應用電子顯微鏡觀察拮抗PPARγ對LPS刺激后小膠質細胞內自噬水平的影響;9.應用mcherry-EGFP-LC3質粒轉染原代小膠質細胞,激光共聚焦觀察拮抗PPARγ對LPS刺激后小膠質細胞內自噬水平的影響;10.應用吞噬實驗觀察拮抗PPARγ對LPS刺激后小膠質細胞吞噬功能的影響;11.應用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-ip)的方法,觀察拮抗PPARγ對LKB1轉錄激活的靶向調控作用;12.應用si RNA轉染原代小膠質細胞和BV2細胞,驗證拮抗PPARγ發(fā)揮的相關調控通路是否被取消。結果:1.羅格列酮激活PPARγ不能抑制LPS所致的原代小膠質細胞M1激活,且不影響小膠質細胞M1-M2型轉化;2.PPARγ拮抗劑T0070907能促進M1型原代小膠質細胞向M2型轉化;3.拮抗PPARγ可逆轉LPS抑制小膠質細胞自噬的作用;4.拮抗PPARγ可促進小膠質細胞自噬的作用依賴于LKB1-AMPK信號通路的激活;5.拮抗PPARγ通過激活LKB1促進M1型小膠質細胞向M2型極化;6.敲除小膠質細胞內PPARγ也可激活LKB1-AMPK信號通路,抑制LPS誘導的小膠質細胞M1型極化。結論:1.拮抗PPARγ促進LPS誘導的M1型小膠質細胞向M2型極化;2.拮抗PPARγ通過增強自噬促進小膠質細胞M1-M2表型的轉變;3.拮抗PPARγ促進小膠質細胞自噬的作用依賴于LKB1-AMPK信號通路的激活。本文工作的主要創(chuàng)新之處:1.確認激活PPARβ/δ的抗抑郁效應;闡明激活PPARβ/δ通過抑制星形膠質細胞內質網應激介導的IRE1α凋亡途徑,進而發(fā)揮對星形膠質細胞的保護作用。為基于“非單胺類”抗抑郁新藥的研發(fā)提供新的思路和實驗依據。2.發(fā)現(xiàn)拮抗PPARγ能促進M1型小膠質細胞向M2型極化的新作用;闡明其促進小膠質細胞M1-M2極化的作用機制是增強LKB1-AMPK信號通路依賴性小膠質細胞的自噬,為抗抑郁癥的抗炎治療和臨床應用提供重要的理論依據。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R749.4

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本文編號：2792229