【摘要】： 阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種最常見的神經(jīng)退行性疾病,神經(jīng)原纖維纏結(neurofibrillary tangle, NFT)和老年斑(senile plaque)為其主要病理特征,神經(jīng)原纖維纏結的數(shù)量與病人認知功能嚴重程度密切相關。構成NFT的主要成分是異常過度磷酸化的微管相關蛋白tau。Tau蛋白的主要功能是促進微管組裝,維持微管穩(wěn)定性,維持神經(jīng)元細胞內(nèi)的軸突運輸。當tau蛋白被異常過度磷酸化,并在細胞內(nèi)形成了聚積后,導致tau蛋白功能異常,引起微管解聚,最后促使神經(jīng)元發(fā)生退行性變。Tau蛋白的磷酸化水平受多種激酶的調(diào)節(jié),尤其是PKA和GSK-3β,在tau蛋白的磷酸化過程中起著重要作用。激酶活性上調(diào)是導致tau蛋白異常過度磷酸化的重要原因。已有研究報道,Tau的過度磷酸化可能是多種激酶聯(lián)合作用的結果,tau的某些位點被一種激酶磷酸化后,可以促進或抑制其他激酶對tau蛋白磷酸化位點的磷酸化,如動物整體和體外試驗表明,PKA對tau蛋白某些位點的預磷酸化可促進GSK-3β對tau的磷酸化作用,在GSK-3β活性不明顯增加的情況下,能促使tau蛋白過度磷酸化,其具體作用機制尚不清楚。為了探討tau的PKA磷酸化位點是如何影響tau蛋白生物學功能,從而闡明體內(nèi)PKA與GSK-3β共同調(diào)節(jié)tau蛋白的磷酸化的機制。我們構建了含不同PKA磷酸化位點突變的tau原核與真核表達重組體,用真核載體在細胞水平,探討tau蛋白PKA磷酸化位點預磷酸化如何改變tau的底物特性、聚積性質(zhì)和生物學功能等。 本實驗分別在HEK293/wt細胞和N2a/wt細胞上瞬時轉染不同重組tau的真核表達載體,再用PKA特異性激活劑forskolin,以及forskolin與GSK-3β特異性抑制劑SB聯(lián)合處理,以確定是GSK-3β的作用,最后分別用免疫印跡技術和免疫熒光技術檢測tau蛋白的磷酸化狀態(tài)及其分布聚集狀態(tài)。 結果顯示:Forskolin可以通過激活PKA,使tau蛋白PKA磷酸化位點磷酸化但不能使其突變位點磷酸化;當tau蛋白409位點的絲氨酸突變?yōu)楸彼釙r,Ser262位點的磷酸化程度減弱,Ser404位點沒有被磷酸化;Tau蛋白409位點的絲氨酸突變?yōu)楣劝彼釙r,Ser262位點的磷酸化程度增強,而Ser404位點依舊沒有被磷酸化; Tau~(S214A)、tau~(S262A)、tau~(S409A)與tau~(S409E)蛋白較tau~(WT)蛋白的Thr231位點的磷酸化狀態(tài)均有不同程度的減弱;Tau~(WT)在forskolin作用下其Ser396/404(PHF-1檢測的位點)的磷酸化程度增加了,而tauS214A、tau~(S262A)及tau~(S409A)在forskolin處理后Ser396/404位點的磷酸化程度均降低了,在forskolin+SB聯(lián)合作用下Ser396/404位點幾乎不能被磷酸化。 以上研究結果表明:1. Ser409位點的磷酸化可以使tauSer262位點更易被相應的激酶磷酸化,并且Ser409突變使Ser404位點不易被磷酸化。2. tau蛋白的Ser214位點的磷酸化可以促進Thr231位點的磷酸化;3. PKA分別預磷酸化tau蛋白的Ser262/409位點,均可以增強GSK-3β對Ser396/404位點的磷酸化作用,使其磷酸化水平明顯增高。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R749.16

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本文編號：2736826