【摘要】： 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease; AD)是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一,其主要病理特征是在大腦易受損區(qū)域的細(xì)胞內(nèi)形成神經(jīng)纖維纏結(jié)(NTF)和細(xì)胞外形成的淀粉樣斑塊(amyloid plaques),又稱老年斑。AD的主要臨床癥狀是進行性記憶缺失,精神行為異常以及認(rèn)知功能障礙等。據(jù)美國權(quán)威機構(gòu)發(fā)表的2007年度AD病評估報告顯示：有510萬美國人患有AD病,其中年齡在65歲以上者約占96%,這部分人又稱為晚發(fā)型(late onset),有20萬的患者是遺傳因素所致的,其年齡小于65歲,為早發(fā)型患者(early onset),預(yù)計到2050年AD患者的人數(shù)將增加三倍。AD患者死亡率已在全美五大最高死亡率疾病中排名第三。目前,我國的AD病人資料也與西方國家接近。因此,AD己成為嚴(yán)重威脅老年人生命質(zhì)量的疾病之一,現(xiàn)在已成為國際上中樞神經(jīng)退行性疾病研究的熱點。 淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein; APP)是研究最為廣泛AD相關(guān)蛋白,它的酶解產(chǎn)物在AD病的致病機理中起著非常重要的作用。APP有三種異構(gòu)體,分別包含770,751和695個氨基酸,APP是跨膜蛋白,在膜上受兩個相鄰的膜內(nèi)蛋白酶β-分泌酶(BACE1, Asp2, Memapsin)和Y-分泌酶的先后切割而產(chǎn)生三個肽段：1)sAPPβ,為分泌至細(xì)胞外的可溶性APP。2) Aβ,為AD的主要毒性產(chǎn)物,含42肽可在神經(jīng)元及突觸之間大量蓄積,形成淀粉樣斑塊,從而導(dǎo)致大腦功能受損,出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀；3) AICD(APP intracellulardomain),即APP細(xì)胞內(nèi)功能區(qū)。針對這一致病機理,許多研究者將降低A p的分泌或其病理聚集,或者是有效清除病理聚集的Aβ斑塊作為治療AD的重要靶點。減少Aβ的分泌可以通過降低β-分泌酶活性或者γ-分泌酶活性的途徑實現(xiàn) β-分泌酶是一種Ⅰ型跨膜天冬氨酰蛋白酶,與它的異構(gòu)體BACE2同屬于胃蛋白酶家族。β-分泌酶位于11號染色體上,由501個氨基酸組成,N端的21個氨基酸組成其信號肽。22-45是未成熟蛋白段,46-460是成熟蛋白,其后是細(xì)胞內(nèi)的17個氨基酸。BACE1含有兩個活性位點在氨基酸93-96和289-292處,每個活性位點都包括高保守序列DT/SGT/S。BACE1序列中含有4個糖基化位點以及六個半胱氨酸以形成三個二硫鍵來維持其空間結(jié)構(gòu)。科學(xué)家在β-分泌酶基因敲除老鼠中發(fā)現(xiàn),這些老鼠健康且多產(chǎn),在組織學(xué),血液學(xué)以及臨床化學(xué)上與對照組野生型老鼠沒有明顯的表型差異,而γ-分泌酶則是由四個跨膜蛋白即早老素,nicastrin, APH1和PEN2構(gòu)成的一個蛋白酶復(fù)合體,除了參與Aβ的生成外還參與了其它的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,如Notch信號途徑,如果干預(yù)γ-分泌酶可能會影響到其它生理過程,產(chǎn)生不利的結(jié)果,相較而言,抑制β-分泌酶是抗APP途徑更為有利藥物靶點。目前,已經(jīng)報道的β-分泌酶抑制劑有很多,但是還沒有一利·藥物能夠真正運用到臨床上來解決患者的痛苦。 噬菌體展示技術(shù)(Phage display technology)是一種簡便有效的淘選酶抑制劑的方法。噬菌體展示是一種基因表達(dá)產(chǎn)物與親和選擇相結(jié)合的技術(shù),他以改構(gòu)的噬菌體為載體,把待選基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白質(zhì)的基因區(qū),使外源多肽或蛋白質(zhì)以融合的形式表達(dá)并展示于噬菌體表面,進而通過親法富集表達(dá)有特異肽或蛋白質(zhì)的噬菌體。其基本步驟包括：1)構(gòu)建起始噬菌體庫,即在噬菌體pⅢ和pⅧ衣殼蛋白的N端插入外源基因,形成的融合蛋白表達(dá)在噬菌體顆粒的表面,不影響和干擾噬菌體的生活周期,同時保持的外源基因天然構(gòu)象,也能被相應(yīng)的抗體或受體所識別,或者擴增已構(gòu)建好的庫；2)利用固定與固相支持物的靶分子,將噬菌體顆粒暴露于靶分子下,使其與靶分子特異性結(jié)合,洗去非特異結(jié)合的噬菌體,篩選出目的噬菌體；3)擴增目的噬菌體,再次將其與靶分子結(jié)合／擴增,經(jīng)過3-4輪的循環(huán)后,外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面,而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測序推導(dǎo)出來；4)將得到的序列進行重組或合成多肽,分析其與靶分子的親和選擇性,最終得到理想的蛋白或肽。 文獻(xiàn)報道利用噬菌體展示技術(shù)成功的篩選到綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa) MurC酶,MurD酶和MurF酶的抑制劑,為抗生素的發(fā)展提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。并且噬菌體展示技術(shù)也成熟的運用到β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)抑制劑的篩選中。 根據(jù)上述資料,我們采用噬菌體隨機多肽展示技術(shù)來篩選β-分泌酶的抑制劑,通過抑制劑阻斷β-分泌酶對其底物APP的切割來降低Aβ的產(chǎn)生,從而為阿爾茨海默病的治療提供一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。 在篩選抑制劑之前,首選要建立一個能夠檢測抑制劑活性的體外平臺。我們通過PCR的方法從人腦基因庫中擴增出BACE1基因,在其N端加入腸激酶酶切位點,C端加入6×His tag,將擴增出的片段插入帶有綠熒光蛋白的pEGFP-C3載體的多克隆位點上,將構(gòu)建的質(zhì)粒(BACE1/pEGFP-C3)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中表達(dá),24小時后收集并裂解細(xì)胞,離心后取上清液,利用親和色譜法(TALON Mental Affinity Resins)純化綠色熒光蛋白／BACE1融合蛋白,用腸激酶常溫下酶切BACE1融合蛋白過夜,將酶切產(chǎn)物再次過柱分離,從而獲得純化的BACE1蛋白。用BACE1活性檢測試劑盒驗證純化蛋白的活性,即利用熒光能量共振轉(zhuǎn)移的方法,有活性的蛋白酶切割熒光底物后,底物與熒光基團分離而產(chǎn)生熒光,根據(jù)熒光信號的強弱來判斷蛋白酶是否有活性,并且可利用此種方法來檢驗BACE1抑制劑的抑制作用。將純化的BACE1加入到含有熒光底物的96孔板中,37℃孵育2h,檢測熒光值的大小來判斷BACE1的活性。經(jīng)過統(tǒng)計分析,純化BACE1組的熒光值1587.115±138.4868(n=3)與標(biāo)準(zhǔn)BACE1組的熒光值1836.629±154.195(n=3)比較,P=0.247,兩組無顯著性差異,說明純化的BACE1在體外具有活性。 將構(gòu)建的BACE1/pEGFP-C3質(zhì)粒和已有的APP/pDsRed-Monomer-N1質(zhì)粒用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)至HEK293細(xì)胞中表達(dá),24h后收集并裂解細(xì)胞,用Western blotting的方法檢測BACE1切割其底物APP的效果,結(jié)果可以看到CTFAPP 0這一條帶的出現(xiàn),提示BACE1在細(xì)胞內(nèi)具有酶切活性。這就為后續(xù)的抑制劑實驗提供了細(xì)胞水平上的檢測平臺,我們可以通過觀察BACE1在細(xì)胞水平對APP的切割效果來判斷篩選出的抑制劑是否有抑制活性。 由于小肽分子量小具有較好的穿透性,同時免疫源性相對也較小而利于實際應(yīng)用,所以我們選擇從Ph.D.-C7CTM噬菌體七肽庫中篩選BACE1的抑制劑。經(jīng)過第一次的淘選后,挑取11個克隆測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有五個克隆的序列是相同的,即Peptide-1 (CPLHARLLC).我們將這個序列合成為二硫鍵環(huán)化的七肽,將其溶解于蒸餾水中,稀釋為100nM,1000nM,10,000nM,100,000nM和1,000,000nM五個濃度,用前面熒光能量共振轉(zhuǎn)移的方法在體外對其抑制活性進行了檢測。經(jīng)統(tǒng)計分析后,五個濃度組的Peptide-1分別與沒有加抑制劑的BACE1組比較,P0.05,說明Peptide-1對BACE1沒有明顯的抑制效果。我們又進行了兩次篩選,得到Peptide-2 (CGYPSLHAC),合成了三種不同的結(jié)構(gòu),并進行了抑制實驗,均未有明顯的抑制活性。我們所獲得的克隆序列均可和BACE1分子結(jié)合,我們的任務(wù)就是從余下的克隆中繼續(xù)篩選找到具有抑制活性的七肽序列并將其運用到細(xì)胞水平和動物水平上。目前我們在改進的基礎(chǔ)上已對再次獲得的結(jié)合肽序列進行了測序,為再一次的抑制劑篩選提供了物資基礎(chǔ)。該實驗?zāi)壳罢谶M行中。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R749.16
【圖文】：

圖 1BACEI的克隆、表達(dá)和純化。A，RCR擴pEGFP一e3的RCR鑒定;C，純化BACEI蛋白 次beads洗脫液的分析，LaneZ是第二次pEGFP一BACEI融合蛋白，Lane4是腸激酶酶 Fig.1Cloning， ExPressingandPurifyingBACE IdentifieationofBACEI/PEGFP一 e3reeombina PurifiedBACEIbyWestemblotting:Lanel， analysisoftheseeondwashbuffer;Lane3，Puri BACEIaftercleavagedbyenterokinase.2.BACEI活性檢測

結(jié)果3.3PhageELISA我們共挑取了n個克隆進行測序，結(jié)果顯示c3，e6，e7，es這五個克隆序列相同，即CPLHARLLC。我們用ELISA的方法CPLHARLLC與BACEI結(jié)合的特異性，結(jié)果如圖4所示，BACEI組的0DMBP對照組oo值相比，只0.01，有顯著性差異，提示CPLHARLLC與BA異性結(jié)合。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王華麗;于欣;;中國阿爾茨海默病的流行病學(xué)現(xiàn)狀[J];中華全科醫(yī)師雜志;2006年06期

本文編號：2728767