【摘要】：中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和再生一直是神經(jīng)科學(xué)界備受關(guān)注的研究領(lǐng)域,傳統(tǒng)觀念認(rèn)為成年哺乳類動物腦組織的神經(jīng)元是終級細(xì)胞,一旦遭受破壞將不能再生。然而,近年來發(fā)現(xiàn)哺乳類動物腦內(nèi)海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)和側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)能夠分化為神經(jīng)細(xì)胞—神經(jīng)發(fā)生(neurogenesis)。因此,新生神經(jīng)元被認(rèn)為能取代自然老化或者病變的神經(jīng)元,最大限度地維護(hù)腦的功能和結(jié)構(gòu)。阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD的主要病理特征為:細(xì)胞外老年斑過度沉積,細(xì)胞內(nèi)形成神經(jīng)纖維纏結(jié)及神經(jīng)元變性、缺失等。新生神經(jīng)元是否能替代病變的神經(jīng)元—神經(jīng)再生(neuroregeneration),改善認(rèn)知功能障礙已成為目前AD研究的一個新焦點。神經(jīng)再生過程主要包括神經(jīng)干細(xì)胞增殖,分化和成熟等。在AD腦和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中,海馬神經(jīng)元前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化比例明顯減少,新生神經(jīng)元的存活率與Aβ產(chǎn)生和沉積的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān),同時新生神經(jīng)元的突起生長異常,提示神經(jīng)再生障礙是導(dǎo)致AD認(rèn)知功能進(jìn)行性減退的重要病理機制之一。細(xì)胞周期阻滯及增殖相關(guān)信號通路的改變是細(xì)胞增殖抑制的兩個主要機制。Aβ聚集使其具有神經(jīng)細(xì)胞毒性,破壞細(xì)胞膜完整性引起細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂,導(dǎo)致細(xì)胞周期異常。在AD患者海馬組織cAMP水平下降,環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)序列結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)磷酸化水平下降,證實了CREB與AD的形成有密切關(guān)系。神經(jīng)甾體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中各種甾體及其代謝產(chǎn)物的總稱。孕酮(progesterone,PROG)是一種重要的內(nèi)源性神經(jīng)甾體,除了在生殖和內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)揮作用,還可影響神經(jīng)系統(tǒng)功能包括促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活,抑制細(xì)胞凋亡,抑制炎癥反應(yīng)等。研究發(fā)現(xiàn)孕酮可促進(jìn)PI3K/AKt信號通路激活,調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurophic factor,BDNF)的合成與釋放。但是關(guān)于孕酮發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機制尚未全完闡明。一方面,孕酮可與其經(jīng)典核受體結(jié)合,通過經(jīng)典基因途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)作用;另一方面,可與細(xì)胞膜上GABA_A受體、NMDA受體、PGRMC1/2受體等結(jié)合,通過非基因途徑發(fā)揮快速調(diào)節(jié)作用。越來越多的證據(jù)表明孕酮可通過非經(jīng)典受體機制發(fā)揮作用,其中研究最多的是孕酮膜結(jié)合蛋白1(progesterone receptor membrane component 1,PGRMC1),其可能是孕酮發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的重要靶點之一。本實驗采用Aβ活性片斷Aβ_(25-35)作用于原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞建立AD細(xì)胞模型,以APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為AD動物模型,分別研究了孕酮在細(xì)胞和動物水平對神經(jīng)再生的影響及相關(guān)機制,為孕酮能用于AD的防治提供理論依據(jù)。第一部分孕酮對AD細(xì)胞模型神經(jīng)再生的影響目的:研究孕酮對AD細(xì)胞模型神經(jīng)干細(xì)胞存活,增殖,凋亡及分化的影響。方法:取新生SD大鼠海馬組織進(jìn)行體外分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化,Immofluorescence方法檢測神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、誘導(dǎo)分化后成熟神經(jīng)元標(biāo)志物βⅢ-Tubulin及星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的表達(dá)情況;采用Aβ_(25-35)處理大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞,建立AD細(xì)胞模型,應(yīng)用CCK-8、Brdu摻入法(Brdu Elisa)、Western blot、Immofluorescence、流式細(xì)胞術(shù)等檢測方法系統(tǒng)性的研究孕酮對Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖、凋亡及分化的影響。結(jié)果:1.大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定神經(jīng)干細(xì)胞純度90%,可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞。2.孕酮對AD細(xì)胞模型神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖及凋亡的影響CCK-8結(jié)果顯示,與對照組相比,20μM Aβ_(25-35)作用48后,大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞明顯損傷,細(xì)胞存活率為對照組的(59.3±6.4)%(P0.01);與Aβ組比較,孕酮能濃度和時間依賴地促進(jìn)Aβ誘導(dǎo)的NSCs存活。在0.01-10μM范圍內(nèi),1μM孕酮對Aβ處理神經(jīng)干細(xì)胞48h,促進(jìn)存活率作用最顯著,其存活率為對照組的(89.6±4.7)%(P0.01)。Immofluorescence結(jié)果顯示,Brdu陽性標(biāo)記位于增殖期細(xì)胞核內(nèi),定位準(zhǔn)確。與對照組相比,Aβ?lián)p傷組Brdu陽性增殖細(xì)胞顯著減少(P0.01)。與Aβ組相比,孕酮保護(hù)組Brdu陽性細(xì)胞顯著增多(P0.01)。與Brdu摻入法結(jié)果一致。Western blot結(jié)果顯示,Aβ誘導(dǎo)的模型組胞漿中cleaved-caspase 3表達(dá)水平為對照組的2.6倍,顯著高于對照組(P0.01)。與模型組相比,Aβ與PROG共孵育后cleaved-caspase 3表達(dá)水平無顯著性差異(P0.05)。3.孕酮對AD細(xì)胞模型神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響Immofluorescence結(jié)果顯示,與對照組相比,Aβ組DCX~+陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低,分化成神經(jīng)元前體細(xì)胞突起顯著縮短(P0.01)。與Aβ組比較,PROG保護(hù)組DCX~+陽性細(xì)胞數(shù)顯著升高,細(xì)胞突起顯著延長(P0.01)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與對照組相比,Aβ?lián)p傷組分化成βⅢ-Tubulin、GFAP陽性細(xì)胞的百分率顯著降低(P0.05)。與Aβ組比較,PROG組分化成βⅢ-Tubulin陽性細(xì)胞的百分率顯著升高(P0.01),分化成GFAP陽性細(xì)胞的百分率無顯著性差異(P0.05)。小結(jié):1.孕酮能濃度和時間依賴地提高Aβ_(25-35)誘導(dǎo)AD細(xì)胞模型神經(jīng)干細(xì)胞的存活率,促進(jìn)其增殖,對神經(jīng)干細(xì)胞凋亡無影響。2.孕酮促進(jìn)Aβ_(25-35)誘導(dǎo)的神經(jīng)元前體細(xì)胞新生,促進(jìn)其突起生長。同時逆轉(zhuǎn)Aβ_(25-35)抑制分化的作用,促進(jìn)向神經(jīng)元分化。第二部分孕酮對AD細(xì)胞模型神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期的影響目的:研究孕酮對AD細(xì)胞模型神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期及其相關(guān)蛋白Cyclin D1、PCNA表達(dá)水平的影響。方法:在大鼠海馬培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞Aβ?lián)p傷所致AD細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上,以神經(jīng)甾體孕酮作為干預(yù)物,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化;應(yīng)用Western blot技術(shù),檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、PCNA表達(dá)。結(jié)果:1.孕酮對AD細(xì)胞模型NSCs細(xì)胞周期的影響與對照組相比,Aβ組G0/G1期細(xì)胞顯著增多,S期細(xì)胞顯著減少,增殖指數(shù)(PI)顯著降低(P0.05)。與Aβ組相比,孕酮保護(hù)組G0/G1期細(xì)胞顯著降低,S期細(xì)胞顯著增多,PI顯著升高(P0.05)。2.孕酮對AD細(xì)胞模型中NSCs細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、PCNA表達(dá)水平的影響Western-blot檢測顯示,與對照組相比,Aβ組Cyclin D1、PCNA蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05)。與Aβ組相比,孕酮保護(hù)組Cyclin D1、PCNA蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05)。小結(jié):孕酮能夠逆轉(zhuǎn)Aβ所致G0/G1期細(xì)胞阻滯,上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、PCNA的表達(dá)水平,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。第三部分孕酮對AD細(xì)胞模型神經(jīng)干細(xì)胞AKt/CREB/BDNF信號通路的影響目的:研究神經(jīng)甾體孕酮對CREB信號通路及其上游PI3K/AKt,下游BDNF三者之間調(diào)控作用。方法:應(yīng)用Western-blot、Brdu摻入法、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測孕酮和Rolipram(p-CREB激活劑)對Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞CREB、BDNF的表達(dá),增殖和分化的影響;應(yīng)用上述方法檢測孕酮和LY294002(PI3K/AKt通路抑制劑)對Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞AKt、CREB及BDNF的表達(dá),增殖和分化的影響。結(jié)果:1.孕酮對AD細(xì)胞模型中神經(jīng)干細(xì)胞CREB/BDNF的影響Western-blot結(jié)果顯示:與Aβ?lián)p傷組相比,PROG保護(hù)組和Rolipram處理組均能引起p-CREB(Ser133)、BDNF蛋白表達(dá)顯著升高(P0.05),各組T-CREB表達(dá)水平組間無顯著性差異(P0.05)。Brdu摻入法及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:與模型組比,PROG保護(hù)組和Rolipram預(yù)處理組顯著促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及向神經(jīng)元分化(P0.05)。2.孕酮AD細(xì)胞模型中神經(jīng)干細(xì)胞PI3K/AKt的影響Western blot結(jié)果顯示:與Aβ?lián)p傷組相比,孕酮保護(hù)組能夠引起p-AKt(Ser473)蛋白表達(dá)顯著升高(P0.05);與PROG保護(hù)組相比,LY294002組p-AKt蛋白表達(dá)顯著降低(P0.05),各組T-AKt、T-CREB表達(dá)水平組間無顯著性差異(P0.05)。此外,各處理組神經(jīng)干細(xì)胞p-CREB、BDNF變化水平與p-AKt一致。Brdu摻入法及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:與模型組比,孕酮組顯著促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及向神經(jīng)元分化(P0.05)。與PROG保護(hù)組相比,LY294002預(yù)處理組顯著抑制NSCs的增殖及向神經(jīng)元分化(P0.05)。小結(jié):孕酮促進(jìn)PI3K/AKt-CREB信號通路的激活,上調(diào)BDNF的表達(dá),發(fā)揮促進(jìn)AD細(xì)胞模型神經(jīng)干細(xì)胞增殖與神經(jīng)元樣分化作用。第四部分孕酮促進(jìn)AD細(xì)胞模型神經(jīng)再生PGRMC1作用的研究目的:研究孕酮是否通過PGRMC1介導(dǎo)AKt/CREB/BDNF信號通路發(fā)揮保護(hù)作用。方法:應(yīng)用Immofluorescence檢測PGRMC1和classic PR在神經(jīng)干細(xì)胞的表達(dá)情況;Western blot檢測Aβ對神經(jīng)干細(xì)胞PGRMC1表達(dá)的影響;構(gòu)建PGRMC1慢病毒載體,慢病毒感染NSCs篩選最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI)及時間;PCR、Western Blot、Brdu Elisa檢測慢病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞后PGRMC1基因和蛋白的表達(dá)情況及慢病毒對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響;Western Blot、Brdu Elisa、流式細(xì)胞術(shù)檢測PGRMC1 siRNA對神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化及AKt、CREB、BDNF表達(dá)的影響結(jié)果:1.PGRMC1在神經(jīng)干細(xì)胞的胞體和細(xì)胞核均有表達(dá),classic PR在神經(jīng)干細(xì)胞中無表達(dá)。2.Aβ對神經(jīng)干細(xì)胞中PGRMC1表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示,Aβ處理48h后,PGRMC1表達(dá)顯著升高。與Ctr組相比,Aβ組PGRMC1的相對表達(dá)量增加了67%(P0.05)。3.慢病毒轉(zhuǎn)染NSCs篩選最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)及時間各組神經(jīng)干細(xì)胞加入慢病毒培養(yǎng)液,于熒光顯微鏡下觀察,慢病毒感染48h,GFP綠色熒光強度隨著MOI值增加而增加,ENi.s+Poly組相比于其它組GFP綠色熒光強度顯著增強(P0.05)。當(dāng)MOI值為20時,GFP綠色熒光分布均勻,大量表達(dá)。以MOI值20感染神經(jīng)干細(xì)胞,隨著時間的延長,GFP綠色熒光從微弱逐漸增強,48h后,與對照組相比,GFP綠色熒光強度顯著增強(P0.05),因此慢病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞最佳培養(yǎng)液為ENi.s+Poly,MOI值為20,時間為48h,用于后續(xù)實驗。4.慢病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞后PGRMC1基因及蛋白表達(dá)水平及增殖的變化NSCs正常組和Scrambled siRNA(隨機序列作為感染陰性對照)組PGRMC1基因和蛋白正常表達(dá)。與正常對照組相比,siRNA 61634基因和蛋白表達(dá)顯著降低(P0.05)。同時Brdu Elisa結(jié)果顯示,與對照組相比,各轉(zhuǎn)染組神經(jīng)干細(xì)胞增殖無顯著性差異(P0.05)。說明siRNA 61634干擾效果較好,可用于后續(xù)實驗。5.PGRMC1 siRNA對AKt/CREB/BDNF信號通路的影響Western blot結(jié)果顯示:與孕酮保護(hù)組相比,siRNA 61634處理組p-CREB蛋白表達(dá)顯著降低(P0.05),大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞中p-AKt、BDNF變化水平與p-CREB一致。Brdu Elisa及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:與孕酮保護(hù)組相比,siRNA 61634處理組顯著抑制了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖及向神經(jīng)元樣分化作用(P0.05)。小結(jié):孕酮部分通過PGRMC1介導(dǎo)調(diào)控AKt/CREB/BDNF信號通路通路,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)的增殖與分化。第五部分孕酮對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)再生和學(xué)習(xí)記憶的影響目的:研究孕酮對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)新生神經(jīng)元存活、分化成成熟神經(jīng)元、空間學(xué)習(xí)記憶的影響及其相關(guān)機制方法:選取APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠作為AD動物模型,頸部皮下注射孕酮,腹腔注射Brdu。應(yīng)用Immofluorescence檢測海馬區(qū)28天齡Brdu~+、Brdu~+/NeuN~+細(xì)胞數(shù),p-AKt、p-CREB蛋白著色情況;應(yīng)用BDNF Elisa試劑盒檢測血清中BDNF變化;應(yīng)用Morris水迷宮檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)的改變。結(jié)果:1.孕酮對APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠海馬區(qū)新生神經(jīng)元存活及分化成成熟神經(jīng)元的影響Immofluorescence結(jié)果顯示:與APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠組比,PROG處理可顯著增加APP/PS1小鼠28天齡-Brdu~+和Brdu~+/NeuN~+數(shù)量(P0.05)。2.孕酮對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)AKt/CREB/BDNF信號通路的影響結(jié)果顯示:APP/PS1小鼠腦區(qū)p-AKt、p-CREB蛋白著色不明顯;與APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠相比,經(jīng)孕酮治療后的小鼠腦區(qū)p-AKt、p-CREB蛋白表達(dá)顯著升高(P0.05)。BDNF Elisa結(jié)果顯示:與APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠相比,經(jīng)孕酮治療后的血液上清液中BDNF顯著升高(P0.01)。3.孕酮對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)的影響Morris水迷宮結(jié)果顯示:在定位航行實驗中:三組小鼠平均游速之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),三組小鼠逃避潛伏期均隨學(xué)習(xí)天數(shù)增加而縮短。孕酮治療組小鼠逃避潛伏期較APP/PS1組顯著縮短(P0.01)。空間探索實驗結(jié)果顯示:與APP/PS1組相比,孕酮組小鼠穿越平臺區(qū)的次數(shù)及平臺所在象限停留時間百分比均顯著增加(P0.01)。小結(jié):孕酮促進(jìn)APP/PS1小鼠海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生,激活A(yù)Kt/CREB/BDNF信號通路,進(jìn)而改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)論:1.孕酮能濃度和時間依賴地提高Aβ_(25-35)誘導(dǎo)AD細(xì)胞模型神經(jīng)干細(xì)胞的存活率,促進(jìn)NSCs增殖。且發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)元前體細(xì)胞新生及其突觸生長,促神經(jīng)元樣分化作用。2.孕酮能夠逆轉(zhuǎn)Aβ所致的G0/G1期細(xì)胞阻滯,上調(diào)Cyclin D1、PCNA的表達(dá);同時通過促進(jìn)PI3K/AKt-CREB信號通路的激活,上調(diào)BDNF的表達(dá)水平,促進(jìn)AD細(xì)胞模型中神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與向神經(jīng)元樣分化。3.孕酮部分通過PGRMC1介導(dǎo)調(diào)控AKt/CREB/BDNF信號通路。4.孕酮促進(jìn)APP/PS1小鼠海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生,激活A(yù)Kt/CREB/BDNF信號通路,改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R749.16
【圖文】：

圖 1-1 新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞純度及誘導(dǎo)分化鑒定1 The identify in purity and differentiation of rat hippocampal neurstem cells.l stem cells stained for Nestin (red), neurons stained for βⅢ-Tubuli), astrocyte stained for GFAP (red) and DAIP was used to stain nucl(blue). Scale bar = 50 μm

34圖 1-2 孕酮促進(jìn) AD 細(xì)胞模型神經(jīng)干細(xì)胞存活率-2 Progesterone promotes the viability of NSCs in the AD cell modeogesterone increases viability of NSCs treated by Aβ inpendent manner. NSCs cultures were exposured to 20μM Aβ25 35wout different concentration of progesterone for 48h, and then assayK-8. (B) Progesterone increases viability of NSCs treated by Aβpendent manner. NSCs cultures were exposed to 20μM Aβ25 35with 1μM progesterone for the indicated times, and then assayed for c. Data are expressed as mean ±SD.△△P<0.01 compared with con1 compared with Aβ.*P<0.05 compared with Aβ.

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2721579