【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種進行性中樞神經系統(tǒng)退行性疾病。其主要病理變化是腦內膽堿能神經元大量丟失和死亡。研究表明在AD病人腦組織中有大量p淀粉樣蛋白(Aβ)沉積。作為細胞存活和功能的重要細胞器,以往研究已經證實線粒體的形態(tài)、運動和功能在AD時會受到影響,但關于其運動的長時程連續(xù)動態(tài)研究尚未見報道。另外,研究也表明AD病人腦內存在膽堿能系統(tǒng)功能異常,而囊泡乙酰膽堿轉運體(vesicular acetylcholine transporter, VAChT)是膽堿能神經系統(tǒng)的重要組成部分,已有文獻通過免疫組化和放射免疫方法證實AD病人腦內VAChT表達降低,但關于該囊泡的細胞內運動過程及在疾病中的作用的研究較少,且研究手段較單一。根據AD的相關病理變化和發(fā)病機制,目前臨床上主要采用膽堿酯酶抑制劑治療AD,加蘭他敏就是其中的一種。關于其作用機制,已有研究證實它能夠抑制Ap聚集、氧化應激和神經元凋亡等。但是,加蘭他敏具體的神經保護機制還沒有完全清楚,有待進一步探討。 本論文首先用Ap蛋白活性片段Aβ25-35誘導高分化PCI2細胞凋亡建立AD體外細胞模型,確定20μM Aβ25-35作用24 h為造模的最佳條件。然后在該模型基礎上,利用激光共聚焦顯微技術、流式細胞術、熒光酶標儀、活細胞工作站、全內反射熒光顯微鏡(TIRFM)、熒光染料染色、質粒轉染、分子生物學技術和計算機圖像處理等,對Aβ25-35誘導PC12細胞線粒體運動和功能變化、VAChT運動和蛋白表達變化及加蘭他敏的神經保護機制進行了研究。結果發(fā)現：(1)Aβ25-35可以誘導PC12細胞線粒體形態(tài)運動和功能異常,在Aβ25-35作用早期,線粒體動力學改變是可逆的,依賴于暴露的時間和藥物濃度；(2)正常情況下PC12細胞中單個囊泡在膜融合之前的轉運,發(fā)現VAChT囊泡的運動主要有3種類型,分別為單個囊泡沿一條軌跡長距離運動、多個囊泡沿同一條軌跡運動和單個囊泡沿一條軌跡的雙向往返運動,且以第1種運動類型最為常見。在此基礎上進一步研究了Aβ25-35對VAChT運動的影響,發(fā)現20μM Aβ25-35作用24 h能明顯抑制VAChT運動。同時檢測到Aβ25-35能顯著抑制VAChT蛋白的表達；(3)加蘭他敏能抑制Aβ25-35聚集、Aβ25-35誘導的內質網鈣釋放、內質網應激相關蛋白GADD153和Grp78/94表達上升和下游的caspase-12活化增加。另外加蘭他敏也能抑制Aβ25-35誘導的線粒體膜電位崩解、ROS產生、細胞色素c釋放、Bcl-2/Bax比值下降和隨后的caspase-9活化,最終抑制caspase-3活化,降低細胞凋亡。以上結果提示線粒體和VAChT在AD發(fā)生過程中起了重要作用,并且加蘭他敏通過線粒體和內質網兩條通路發(fā)揮了抗凋亡及神經保護作用；為進一步理解AD的病理機制提供了理論基礎,也為相關藥物研發(fā)提供了新的藥物靶點。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

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本文編號：2675423