【摘要】： 前言 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種以進行性癡呆為臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。隨著人口的逐漸老齡化,AD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,給社會和家庭帶來了沉重的負擔,由于缺乏有效的治療手段,AD已成為危害人類健康的主要致死性疾病之一。AD典型病理特征包括:β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)在腦內(nèi)神經(jīng)元外病理性沉積形成的老年斑(senile plaques,SP)、神經(jīng)元內(nèi)微絲微管高度螺旋化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)和神經(jīng)元的大量丟失。到目前為止,AD的具體發(fā)病機制還不是十分清楚,但越來越多的證據(jù)表明,神經(jīng)元凋亡是導致神經(jīng)元丟失的重要原因,神經(jīng)元的大量丟失致使AD患者認知功能的進行性下降。現(xiàn)在普遍認為細胞凋亡是一系列高度調(diào)控的半胱氨酸蛋白酶caspase級聯(lián)反應事件的結(jié)果,其中caspase-3被證實處于該級聯(lián)反應的下游,它通過降解細胞內(nèi)相應底物使細胞死亡,是凋亡事件的真正執(zhí)行者。海馬結(jié)構與學習記憶功能密切相關,且是AD最早和最易受損的部位,因此,海馬結(jié)構神經(jīng)元的凋亡直接影響到AD患者的認知功能。目前多數(shù)學者認為:Aβ在腦組織中的沉積是各種原因誘發(fā)AD的共同通路,也是AD形成和發(fā)展的關鍵因素�，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明:Aβ的異常沉積可以啟動細胞內(nèi)多種蛋白參與的系列級聯(lián)反應,誘導神經(jīng)毒性,損傷神經(jīng)系統(tǒng),導致患者出現(xiàn)認知功能障礙等。但究竟有哪些蛋白和酶參與了Aβ誘導神經(jīng)毒性損傷,以及這些蛋白分子之間的相互作用和調(diào)控機制如何?目前尚未完全闡明。因此,進一步探討Aβ致神經(jīng)元損傷作用具有重要的理論意義和臨床價值。 PI3-K/Akt信號通路是細胞內(nèi)重要的促細胞存活途徑,PI3-K在生長因子受體等胞外信號活化后,通過磷酸化下游蛋白激酶Akt而使其活化,活化的Akt可以磷酸化凋亡相關基因,使促凋亡基因失活、抗凋亡基因活化,從而起到抑制細胞凋亡及促進細胞存活的作用。那么,Aβ致神經(jīng)元損傷作用是否與抑制了Akt的活化有關呢?關于這方面的研究國內(nèi)外報道尚少。 多奈哌齊(Donepezil,DN)作為一種選擇性的膽堿酯酶抑制劑而用于臨床AD的治療,能明顯提高AD患者的學習記憶能力。目前體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)DN可減少自由基的產(chǎn)生、抑制谷氨酸的興奮性毒性,但其是否可減少Aβ誘導的神經(jīng)元凋亡,抑制凋亡相關基因caspase-3的表達,以及此作用是否與Akt的活化有關等研究國內(nèi)外報道還很少。 因此,本研究擬采用體內(nèi)外研究相結(jié)合的方法,分別進行體外Aβ干預大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(Phaeochromocytoma cell,PC12細胞),體內(nèi)大鼠側(cè)腦室注射Aβ,同時給予多奈哌齊進行治療,探討Aβ對神經(jīng)元的損傷作用及多奈哌齊對海馬結(jié)構神經(jīng)元的保護作用以及它們作用的可能機制。從而進一步研究Aβ的神經(jīng)毒性,同時為DN的臨床應用提供可靠的實驗依據(jù),為預防或治療AD及其藥物開發(fā)奠定理論基礎。 材料與方法 一、體外研究 1、細胞培養(yǎng):PC12細胞在含10%胎牛血清、5%馬血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,37℃,5%CO_2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。 2、MTT比色法:選用不同濃度Aβ_(25-35)誘導PC12細胞,24h后檢測各濃度細胞的存活率,并選擇Aβ_(25-35)的最適濃度建立神經(jīng)元損傷模型。將細胞分為對照組、模型組,即:未經(jīng)處理的PC12細胞作為對照組,最適濃度Aβ_(25-35)干預組為模型組。 3、流式細胞術:分別檢測上述兩組PC12細胞的凋亡率。 4、細胞免疫組化法:分別檢測上述兩組PC12細胞caspase-3的表達。 二、體內(nèi)研究 1、實驗動物及分組:選用中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供的雄性Wistar大鼠36只,3月齡,體重250～300g。適應性飼養(yǎng)1w后,將大鼠隨機分為3組,即對照組、模型組及治療組,每組各12只。模型組、治療組大鼠側(cè)腦室注射Aβ_(25-35)10μl(1μg/μl),對照組大鼠采用相同方法注射等量0.9%生理鹽水。治療組于側(cè)腦室注射后第3d開始腹腔注射多奈哌齊1.5mg·kg~(-1)·d~(-1),正常對照組、模型組給予等量生理鹽水,持續(xù)4w。 2、Morris水迷宮行為學測試:測試各組大鼠的近期學習記憶能力,記錄其每個時間段的平均逃避潛伏期。 3、免疫組織化學染色法:觀察各組大鼠海馬結(jié)構神經(jīng)元caspase-3陽性細胞的分布和表達情況。 4、Western blot方法:分析各組大鼠海馬結(jié)構T-Akt、P-Akt的表達水平。 三、統(tǒng)計學分析 結(jié)合圖像采集分析系統(tǒng),體內(nèi)外研究的全部實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差((?)±s)表示,應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件,用單因素方差分析方法進行組間比較,p＜0.05為有統(tǒng)計學意義,p＜0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。 實驗結(jié)果 一、體外實驗結(jié)果 1、MTT比色法:檢測到PC12細胞活性呈Aβ_(25-35)濃度依賴性下降,Aβ_(25-35)的最適作用濃度是20μM。 2、流式細胞術:檢測到模型組PC12的凋亡率較對照組明顯增加。 3、免疫組化染色:模型組caspase-3的表達較對照組明顯增多(p＜0.01)。 二、體內(nèi)實驗結(jié)果 1、Morris水迷宮測試:模型組大鼠各時間段的平均潛伏期較對照組延長(p＜0.01),而治療組各時間段的平均潛伏期較模型組縮短(p＜0.05)。 2、免疫組織化學方法:caspase-3陽性反應產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色細顆粒狀,主要沉積在海馬結(jié)構CA1、CA3區(qū)的錐體細胞層及齒狀回(DG)的顆粒細胞層。對照組大鼠海馬結(jié)構3個亞區(qū)可見少量的caspase-3陽性神經(jīng)元;模型組陽性神經(jīng)元較多,陽性反應產(chǎn)物著色較對照組加深,平均光密度值均較對照組明顯增高(p＜0.01);而治療組caspase-3陽性反應產(chǎn)物的平均光密度值均較模型組減少(p＜0.05)。 3、Western blot方法:三組大鼠海馬結(jié)構的T-Akt的表達量無顯著差異(p＞0.05),模型組P-Akt的表達較對照組降低(p＜0.05),治療組P-Akt的表達量相對于模型組呈升高趨勢(p＜0.05)。 結(jié)論 1、Aβ_(25-35)誘導神經(jīng)元凋亡與其促凋亡基因caspase-3的高表達有關。 2、Aβ_(25-35)促caspase-3的表達可能與其抑制了Akt的磷酸化水平有關。 3、多奈哌齊減少大鼠海馬結(jié)構神經(jīng)元caspase-3的表達可能與其上調(diào)Akt的磷酸化水平有關。
【圖文】：

MTT法檢測不同濃度A民5一35處理24h后PclZ細胞的活性(‘乍<0.05)二、PC12細胞的凋亡率流式細胞技術檢測發(fā)現(xiàn)(圖2)20卜MA民5一35干預PclZ細胞24h后，DNA直方圖上可見GO/GI峰前出現(xiàn)1個明顯的亞2倍體峰(即凋亡峰)，統(tǒng)計學分析(表1)顯示模型組凋亡率為23.03士1.22%，而對照組凋亡率為2.42士0.87%勿<0.01)。t沖七ns勺勻二電g減.‘氣杖時伽5咚偽，，6、〕 p62娜g口口兇皿只幽C卜一nne奮，(rLZH)C卜.n六七卜(「吐H〕a:對照組b:模型組圖2，流式細胞儀檢測A民5一35處理PC12細胞DNA含量變化三、PC12細胞的形態(tài)學觀察倒置顯微鏡下觀察到對照組PclZ細胞(照片la)多呈圓形或橢圓形，胞體飽滿，折光度好
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R749.16

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本文編號：2663686