【摘要】：晝夜節(jié)律系統(tǒng)正常功能的維持在各個(gè)生命領(lǐng)域都是不可或缺的。出現(xiàn)于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)早期的晝夜節(jié)律紊亂(Circadian rhythm disorder,CRD),嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量并可加重AD的發(fā)生發(fā)展,故尋找針對(duì)AD晝夜節(jié)律紊亂的治療手段意義重大。β淀粉樣蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)在近年來被認(rèn)為與AD晝夜節(jié)律紊亂的形成關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn),2型糖尿病和AD在病理表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制中存在諸多相似性,這可能為AD的治療提供了新的探索方向。胃泌酸調(diào)節(jié)素(Oxyntomodulin,OXM)作為體內(nèi)天然的胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)/胰高血糖素雙受體激動(dòng)劑,是一種新型糖尿病治療藥物,目前OXM類似物D-Ser2-Oxyntomodulin(Oxy)的神經(jīng)保護(hù)作用已經(jīng)逐漸被證實(shí)且其在腦中發(fā)揮效應(yīng)主要依賴于GLP-1受體的活化。但Oxy對(duì)AD晝夜節(jié)律紊亂是否也有改善作用尚不明確。本研究在動(dòng)物水平通過小鼠自主跑輪行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)Oxy對(duì)Aβ31-35所致小鼠晝夜節(jié)律紊亂和海馬生物鐘基因Bmal1和Per2異常表達(dá)具有改善作用,在離體水平證實(shí)Oxy以劑量依賴的方式拮抗Aβ31-35對(duì)小鼠海馬HT22神經(jīng)細(xì)胞系的毒性作用,同時(shí)使用Real-time PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)明確Oxy可顯著改善Aβ31-35所致HT22細(xì)胞內(nèi)生物鐘基因Bmal1和Per2異常表達(dá)。使用慢病毒干擾GLP-1受體基因后發(fā)現(xiàn),GLP-1受體基因沉默可誘導(dǎo)生物鐘基因Bmal1和Per2異常表達(dá),且此時(shí)Oxy無法繼續(xù)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。以上結(jié)果表明Oxy可顯著改善Aβ31-35所致晝夜節(jié)律紊亂和生物鐘基因異常表達(dá),且GLP-1受體在Oxy發(fā)揮改善效應(yīng)過程中起著重要作用,這為AD患者晝夜節(jié)律紊亂的防治提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)支持。第一部分Aβ31-35誘導(dǎo)晝夜節(jié)律紊亂及生物鐘基因表達(dá)異常目的:驗(yàn)證Aβ31-35可誘導(dǎo)小鼠晝夜節(jié)律紊亂的發(fā)生、小鼠海馬內(nèi)生物鐘基因的異常表達(dá)及小鼠海馬HT22細(xì)胞生物鐘基因的異常表達(dá)。方法:將6-8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2組:Control組、Aβ31-35組。應(yīng)用跑輪行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察小鼠的晝夜跑輪節(jié)律活動(dòng),檢測(cè)小鼠運(yùn)動(dòng)活性、自由運(yùn)轉(zhuǎn)周期和晝/夜活動(dòng)量變化。使用Real-time PCR檢測(cè)小鼠海馬內(nèi)生物鐘基因Bmal1和Per2的節(jié)律性變化。選取小鼠海馬HT22神經(jīng)細(xì)胞系并分為Control組和Aβ31-35組,用CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Aβ31-35為2.5,5和10μM時(shí)細(xì)胞存活率,Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)Aβ31-35劑量為5μM時(shí)HT22細(xì)胞生物鐘基因在不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平改變。結(jié)果:(1)與Control組相比,Aβ31-35組小鼠的跑輪活動(dòng)較為散亂,每日睡眠-運(yùn)動(dòng)模式無規(guī)律,運(yùn)動(dòng)活性降低、自由運(yùn)轉(zhuǎn)周期延長及小鼠主觀白天活動(dòng)量增加。(2)與Control組相比,Aβ31-35組小鼠海馬生物鐘基因Bmal1和Per2 mRNA表達(dá)出現(xiàn)相位延遲,分別在CT20和CT16時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平明顯降低。(3)2.5,5和10μM Aβ31-35可致HT22細(xì)胞存活率顯著降低,與Control組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(4)與Control組相比,Aβ31-35組HT22細(xì)胞內(nèi)Bmal1和Per2出現(xiàn)異常表達(dá),分別在CT20和CT16時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)mRNA和蛋白表達(dá)水平的明顯降低。結(jié)論:Aβ31-35可以誘導(dǎo)小鼠晝夜節(jié)律紊亂及生物鐘基因Bmal1和Per2表達(dá)異常。第二部分D-Ser2-Oxyntomodulin(Oxy)改善Aβ31-35所致晝夜節(jié)律紊亂及生物鐘基因表達(dá)異常目的:驗(yàn)證D-Ser2-Oxyntomodulin(Oxy)對(duì)Aβ31-35所致小鼠晝夜節(jié)律紊亂、小鼠海馬內(nèi)生物鐘基因的異常表達(dá)及小鼠海馬HT22細(xì)胞生物鐘基因的異常表達(dá)的改善作用。方法:將6-8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組:Control組、Aβ31-35組、Oxy預(yù)處理組(Oxy+Aβ31-35組)及Oxy單獨(dú)給藥組(Oxy組),應(yīng)用跑輪行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察各組小鼠的晝夜跑輪運(yùn)動(dòng)節(jié)律,檢測(cè)小鼠運(yùn)動(dòng)活性、自由運(yùn)轉(zhuǎn)周期和晝/夜活動(dòng)量變化。使用Real-time PCR檢測(cè)小鼠海馬內(nèi)Bmal1和Per2的節(jié)律性變化。選取小鼠海馬HT22神經(jīng)細(xì)胞系也分為以上四組,CCK-8法檢測(cè)Oxy對(duì)細(xì)胞存活率影響,Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)Oxy對(duì)Bmal1和Per2異常表達(dá)的作用。結(jié)果:(1)與Aβ31-35組小鼠相比,Oxy預(yù)處理組小鼠跑輪活動(dòng)較為規(guī)律,每日睡眠-運(yùn)動(dòng)的模式較為固定,運(yùn)動(dòng)活性升高,自由運(yùn)轉(zhuǎn)周期縮短,主管白天活動(dòng)量相對(duì)減少。(2)與Aβ31-35組相比,Oxy預(yù)處理組小鼠海馬內(nèi)生物鐘基因Bmal1和Per2 mRNA表達(dá)相位的延遲有所恢復(fù),表達(dá)水平分別在CT20和CT16顯著提高。(3)1,10,100,200 nM Oxy預(yù)處理均可改善Aβ31-35所致HT22細(xì)胞存活率的降低,其中100和200 nM劑量可致細(xì)胞存活率顯著提高,與5μM Aβ31-35組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(4)與Aβ31-35組相比,Oxy預(yù)處理組HT22細(xì)胞內(nèi)Bmal1和Per2 mRNA和蛋白的異常表達(dá)得到改善,表現(xiàn)為表達(dá)水平分別在CT20和CT16顯著提高。結(jié)論:Oxy對(duì)Aβ31-35所致晝夜節(jié)律紊亂及生物鐘基因Bmal1和Per2表達(dá)異常具有改善作用。第三部分GLP-1受體參與Oxy改善Aβ31-35所致HT22細(xì)胞生物鐘基因異常表達(dá)目的:觀察GLP-1受體基因沉默后對(duì)HT22細(xì)胞內(nèi)生物鐘基因表達(dá)的影響,觀察此時(shí)Oxy對(duì)Aβ31-35所致生物鐘基因異常表達(dá)是否仍具有改善作用。方法:首先使用含GLP-1R-shRNA-GFP的慢病毒質(zhì)粒對(duì)HT22細(xì)胞進(jìn)行感染,鏡下觀察感染效率,并使用Real-time PCR和Western Blot檢驗(yàn)沉默效率。將GLP-1R基因沉默的HT22細(xì)胞分為四組:慢病毒組(LV-shGLP-1R組)、慢病毒+Aβ31-35組(LV-shGLP-1R+Aβ31-35組)、慢病毒+Oxy+Aβ31-35組(LV-shGLP-1R+Oxy+Aβ31-35組)和慢病毒+Oxy組(LV-shGLP-1R+Oxy組)。同時(shí)將未經(jīng)感染的HT22細(xì)胞作為Control組,Real-time PCR檢測(cè)各組在CT4、CT8、CT12、CT16、CT20和CT24共6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)生物鐘基因Bmal1和Per2的節(jié)律性表達(dá)。結(jié)果:(1)與Control組相比,LV-shGLP-1R組細(xì)胞內(nèi)生物鐘基因Bmal1和Per2表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有所下降。(2)與LV-shGLP-1R+Aβ31-35組相比,LV-shGLP-1R+Oxy+Aβ31-35組細(xì)胞內(nèi)Bmal1和Per2的異常節(jié)律性表達(dá)無明顯改善。結(jié)論:GLP-1受體基因沉默誘導(dǎo)HT22細(xì)胞生物鐘基因Bmal1和Per2的表達(dá)水平降低,且GLP-1R基因沉默后,Oxy無法改善Aβ31-35在HT22細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)的Bmal1和Per2異常表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 李亞蒙;王麗;趙學(xué)玲;張蕊;趙今;原媛;王曉暉;;胰高血糖素樣肽-1受體在β淀粉樣蛋白31-35對(duì)HT22神經(jīng)細(xì)胞節(jié)律基因per2影響中的作用[J];中國藥物與臨床;2017年02期

2 韓宇飛;H?LSCHER Christian;王昭君;張軍;原麗;仝嘉慶;王丹丹;武美娜;祁金順;;抗糖尿病新藥(D-Ser2)Oxm拮抗淀粉樣β蛋白細(xì)胞毒性的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)觀察[J];生理學(xué)報(bào);2016年03期

3 Nigel Irwin;Peter R Flatt;;New perspectives on exploitation of incretin peptides for the treatment of diabetes and related disorders[J];World Journal of Diabetes;2015年15期

4 Antonio Brunetti;Eusebio Chiefari;Daniela Foti;;Recent advances in the molecular genetics of type 2 diabetes mellitus[J];World Journal of Diabetes;2014年02期

，

本文編號(hào)：2662081