【摘要】： 前言 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是發(fā)生在老年人群的一種以進(jìn)行性癡呆和情感障礙為臨床特征的神經(jīng)退行性疾病。AD最主要的病理學(xué)特征是細(xì)胞外出現(xiàn)大量的以β-淀粉樣蛋白(amyloid-βprotein, Aβ)為主要組成成分的老年斑。Ap是由淀粉樣肽前體蛋白(amyloid-βprecursor protein, APP)經(jīng)分泌酶剪切產(chǎn)生。APP的外功能區(qū)首先由β-分泌酶剪切并產(chǎn)生一個APP C-端片段,此片段進(jìn)一步由γ-分泌酶復(fù)合體在其跨膜區(qū)域進(jìn)行剪切,進(jìn)而形成Aβ多肽。APP以及它的蛋白水解產(chǎn)物Aβ都是金屬蛋白,分子上有鋅結(jié)合位點(diǎn),鋅離子與這些蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性密切相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)在AD患者的大腦以及轉(zhuǎn)基因小鼠大腦Aβ老年斑內(nèi)有大量鋅離子沉積,鋅離子通過調(diào)節(jié)mRNA的5'-UTR來促進(jìn)APP的表達(dá),更重要的是體外實(shí)驗(yàn)證明鋅離子通過共價鍵與相鄰兩條Aβ分子第13位上的組氨酸結(jié)合,從而使Aβ聚合并形成纖維狀沉積。此外,鋅螯合劑CQ、DP-109等都可以降低腦內(nèi)鋅含量,改善AD病人的認(rèn)知功能狀態(tài),抑制AD轉(zhuǎn)基因小鼠大腦內(nèi)老年斑的形成。綜上可見,AD腦中鋅含量的異�？赡苁菍�(dǎo)致Aβ積聚的一個重要因素,改善鋅代謝紊亂可能是治療AD的一個潛在策略。在動物在體水平,鋅離子對AD發(fā)病的病理過程及老年斑形成的影響機(jī)制目前尚無詳細(xì)報道。因此,本研究以AD模型小鼠-APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠做為實(shí)驗(yàn)對象,分別用鋅離子和鋅螯合劑氯碘羥喹(clioquinol, CQ)處理動物,結(jié)合行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等手段,檢測鋅離子對APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、腦內(nèi)老年斑形成、APP蛋白及其酶切產(chǎn)物以及Aβ分泌的影響,揭示鋅離子參與AD病理生理過程的分子機(jī)制。 材料與方法 42只3月齡健康雄性C57BL／6小鼠,隨機(jī)均分為3組：(1)正常對照組；(2)溶劑對照組：腹腔注射等量二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO); (3) CQ組：腹腔注射CQ (Sigma, 100mg/kg,用DMSO溶解為1％的儲存液)。斷頭取腦,做TSQ熒光探針染色和金屬自顯影技術(shù)(AMG)組織化學(xué)染色。 48只3月齡雄性APP／PS1轉(zhuǎn)基因鼠隨機(jī)均分為4組：(1)正常對照組；(2)高鋅組(喂飼含ZnSO4的水,濃度20mg/ml); (3)鋅+CQ組(喂飼含ZnSO4的水,濃度20mg/ml,至7月齡時管飼法給予20mg／kg的CQ)；(4)CQ組(7月齡時管飼法給予20mg／kg的CQ)。每天記錄一次體重變化。當(dāng)小鼠到9月齡時,做Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),檢測各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。隨后心臟取血并分離血清,進(jìn)行原子吸收光譜檢測,分析各組小鼠血清鋅的變化。斷頭取腦,大腦左半球固定做冰凍切片,右半球分離皮層和海馬,做分子生物學(xué)檢測。應(yīng)用AMG和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測各組小鼠腦內(nèi)Aβ老年斑的變化；應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測各組小鼠大腦皮層APP、ADAM10、BACE1、PS1、sAPPα、sAPPβ蛋白表達(dá)的變化；應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測Aβ在各組小鼠大腦皮層的含量。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.CQ對鋅離子螯合作用的檢測 腹腔注射CQ組小鼠大腦鋅離子的TSQ熒光探針染色和AMG組織化學(xué)染色均明顯低于正常對照組和溶劑對照組,而溶劑對照組和正常對照組之間沒有明顯差異。 2.鋅離子致轉(zhuǎn)基因鼠體重及血清鋅、腦鋅含量的變化 與對照組相比,給鋅組轉(zhuǎn)基因鼠的體重顯著下降,毛色變棕黃,血清鋅、腦鋅含量顯著增高。鋅螯合劑CQ能逆轉(zhuǎn)鋅對APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠的毒性作用,但是其自身對轉(zhuǎn)基因鼠的膚色和體重沒有影響。 3.鋅離子對轉(zhuǎn)基因鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 與對照組相比,給鋅組轉(zhuǎn)基因鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和空間探索能力均顯著降低,而鋅螯合劑CQ能一定程度改善高鋅喂養(yǎng)對APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響,并且其本身也能顯著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠的認(rèn)知能力。 4.鋅離子對轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)老年斑形成的影響 與對照組相比,給鋅組轉(zhuǎn)基因鼠的大腦皮層、海馬的老年斑塊明顯增多。鋅螯合劑CQ能減緩鋅對老年斑形成的促進(jìn)作用,CQ本身亦能顯著降低轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)老年斑的數(shù)量。 5.鋅離子對轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)APP蛋白及其分解酶、分解產(chǎn)物表達(dá)的影響 與對照組相比,給鋅組轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)APP、BACE1、PS1、sAPPβ蛋白表達(dá)明顯增多,Aβ含量明顯增加,ADAM10和sAPPa表達(dá)下降；CQ組轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)APP、BACE1、PS1、sAPPβ蛋白表達(dá)和可溶性Aβ含量減少,ADAM10和sAPPa蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。 結(jié)論 1.CQ對游離鋅離子有明顯的螯合作用。 2.高鋅使APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠的體重下降,血清鋅、腦鋅含量升高。 3.高鋅使APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠的認(rèn)知能力顯著下降。 4.高鋅能促進(jìn)APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)老年斑的生成。 5.高鋅能影響APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)APP、APP代謝酶及其產(chǎn)物表達(dá)。
【圖文】：

AMG組織化學(xué)染色顯示大腦Cx(皮層)，海馬CA3區(qū)、DG(齒狀回)游離鋅離子分布。注:**P<0.ol，““六0.01。3、鋅離子致轉(zhuǎn)基因鼠體重及血清鋅、腦鋅含量的變化，川一洲丁對一照紅}_{州比，高鋅喂介糾APP/P51轉(zhuǎn)J間川鼠從:‘、){齡始j主漸仁色發(fā)位，體幣j、一l二羊(圖3A)，全!J九月齡[l、J，體重l叼{:;!低J幾l卜‘}、，了、j照了11(尸<。.()5)({冬{3B).鋅鰲合劑CQ能減緩高鋅對APP/PSI轉(zhuǎn)基因鼠的毒害作用，但其自身對APP/PSl轉(zhuǎn)荃因鼠的毛色，體重沒有影響(圖3A，B)。各組小鼠行為學(xué)檢測完后，通過原子吸收光譜法我們進(jìn)一步檢測了血清鋅和腦鋅含量的變化。高鋅喂養(yǎng)組小鼠血清鋅和腦鋅含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它三組小鼠血清鋅和腦鋅含量(凡0.01)(圖3C，D)，cQ能降低飲食中高鋅致使轉(zhuǎn)基因鼠血清鋅和腦鋅含量的增加，但是其本身卻對轉(zhuǎn)基因鼠血清鋅和腦鋅含量沒有影響(圖3C，，D)。

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本文編號：2643453