【摘要】：背景與目的:阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一,其病理表現(xiàn)為β淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)沉積形成的老年斑、tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangles,NFT)以及大量神經(jīng)元的丟失。AD可分為散發(fā)性AD(Sporadic Alzheimer’s Disease,SAD)與家族性AD(Familial Alzheimer’s Disease,FAD),臨床上以SAD多見。AD起病隱匿,其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,尤其是對早期AD了解相對不足。AD可人為劃分為無癥狀臨床前階段及癡呆階段,目前認(rèn)為這兩個階段的過渡是一個連續(xù)的過程,因此,FAD家系成員是觀察AD臨床前階段及AD發(fā)展的的理想人群。微小RNA(MicroRNAs,MiRNAs)是大小約為18-25個核苷具有轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控功能的單鏈非編碼小RNA。MiRNAs與AD被廣泛研究,但FAD與miRNAs目前研究較少。本實驗用高通量Illumina測序技術(shù),對PSEN1基因p.G378E突變致病的早發(fā)型家族性阿爾茨海默病(Early-onset familial Alzheimer disease,EOFAD)患者外周血單個核細(xì)胞行miRNAs的表達(dá)譜檢測,并行靶基因預(yù)測及初步功能分析,探討EOFAD中miRNAs的作用機(jī)制,為了解miRNAs在AD中的發(fā)病機(jī)制以及AD發(fā)生、發(fā)展的過程提供幫助。方法:選取2名EOFAD患者及2名正常對照者,分別抽取他們4ml外周血,應(yīng)用淋巴細(xì)胞分析液進(jìn)行單個核細(xì)胞分離,提取總RNA,并分離miRNAs。應(yīng)用高通量Illumina HiSeq 2500測序技術(shù)對EOFAD患者和正常對照者的外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行miRNAs表達(dá)譜檢測,并分析篩選出具有差異表達(dá)的miRNAs。通過對miRanda數(shù)據(jù)庫和TargetScan數(shù)據(jù)庫的搜索,進(jìn)行差異表達(dá)miRNAs的靶基因預(yù)測,分別搜索得出每個數(shù)據(jù)庫預(yù)測的靶基因,然后匯總2個數(shù)據(jù)庫的結(jié)果得到共同靶基因(mRNAs)。根據(jù)GO數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫對預(yù)測的靶基因進(jìn)行功能注釋,從而篩選出差異基因體現(xiàn)的顯著性功能和顯著性的通路。結(jié)果:EOFAD患者與正常對照者的外周血單個核細(xì)胞相比,共有142個差異表達(dá)miRNAs,其中90個上調(diào)的miRNAs以及52個下調(diào)的miRNAs(p0.05,FC1.2或FC0.833)。若以p值0.05,FC2或FC0.5進(jìn)行差異基因篩選,則有121個差異miRNAs,其中76個上調(diào)的miRNAs以及45個下調(diào)的miRNAs,其中明顯差異表達(dá)的有hsa-miR-3614-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-27a-5p等。通過對miRanda數(shù)據(jù)庫和TargetScan數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測靶基因并匯總結(jié)果,共得到768個靶基因。對預(yù)測的靶基因行GO分析發(fā)現(xiàn),EOFAD組與NC組上調(diào)miRNAs預(yù)測的靶基因的前三位顯著性GO為:細(xì)胞-基底連接、粘著細(xì)胞-基質(zhì)粘附連接;EOFAD組與NC組下調(diào)miRNAs預(yù)測的靶基因的前五位的顯著性GO為:mRNA分解代謝過程、粘著斑、細(xì)胞-基質(zhì)粘附連接、細(xì)胞-基底連接、鈣粘蛋白結(jié)合。另外,靶基因除參與上述功能外,還與信使RNA分解、RNA分解、細(xì)胞周期調(diào)控、Wnt信號通路等生理過程有關(guān)。對預(yù)測的靶基因行KEGG分析發(fā)現(xiàn),EOFAD組與NC組上調(diào)miRNAs預(yù)測的靶基因的前三位顯著性通路為癌癥中的蛋白多糖通路、細(xì)胞衰老通路、前列腺癌通路;EOFAD組與NC組下調(diào)miRNAs預(yù)測的靶基因的前三位顯著性通路為病毒致癌作用通路、癌癥中的蛋白多糖通路、甲狀腺激素信號通路。另外,靶基因除參與上述信號通路外,還參與神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、FoxO信號通路、MAPK信號通路、Wnt信號通路、Ras信號通路、細(xì)胞衰老、細(xì)胞周期等通路。結(jié)論:高通量測序是一項較為有效的檢測EOFAD患者外周血單個核細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜的方法。EOFAD患者與正常人相比,有明顯差異表達(dá)的miRNAs,其中hsa-miR-3614-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-206、hsa-miR-27a-5p等miRNAs具有明顯差異表達(dá),這些miRNAs可能參與信使RNA分解、核糖核酸分解、細(xì)胞周期調(diào)控等生理過程以及甲狀腺激素信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子通路、MAPK信號通路、Wnt信號通路、FoxO信號通路、Ras信號通路等信號通路參與EOFAD的發(fā)病。
【圖文】：

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院碩士專業(yè)學(xué)位論文FAD 組與 NC 組差異表達(dá) miRNAs 譜分析2.1 聚類圖分析：用差異篩選得到的差異 miRNAs，根據(jù)每個 miRNA 在樣本分別對 miRNAs 和樣本進(jìn)行聚類分析，，從 miRNA 的聚類結(jié) EOFAD 患者差異表達(dá)的 miRNAs 聚為一類，具有相似的表有類似的功能。NC 組差異表達(dá)的 miRNAs 聚為一類具有相，可能具有類似的功能。如圖 1 所示為 EOFAD 組與 NC 組細(xì)胞的差異 miRNAs 聚類圖。

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院碩士專業(yè)學(xué)位論文火山圖分析示 EOFAD 組和 NC 組差異的整體情況，從差異倍數(shù)差異的顯著性水平（p-value，P 值）兩個方向?qū)?EOF異進(jìn)行評估。應(yīng)用火山圖進(jìn)行展示，每個點代表一個基NAs 為 FC ＞1.2 且 p＜ 0.05，用紅點表示。下調(diào) miR且 p＜ 0.05，用藍(lán)點表示。無差異表達(dá)的 miRNAs 用灰。
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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1 王全全;郝延磊;楊燕;孔慶霞;周樹虎;呂占云;;早老素1基因p.G378E突變導(dǎo)致的早發(fā)家族性阿爾茨海默病一家系[J];中華神經(jīng)科雜志;2017年03期

2 楊士勇;江曉春;;miRNA與惡性腫瘤關(guān)系研究進(jìn)展[J];濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2013年06期

3 詹向紅;王友杰;閆國立;史曉紅;李偉;楊麗萍;劉勝利;劉高建;梁鶴;王淑玲;;阿爾茨海默病相關(guān)因素分析[J];中國老年學(xué)雜志;2012年21期

本文編號：2635399