【摘要】：目的構(gòu)建小鼠髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-2(The triggering receptor expressed on myeloid cells-2,TREM2)基因過(guò)表達(dá)和短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干擾慢病毒載體,并通過(guò)對(duì)小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞感染進(jìn)行鑒定。方法1.小鼠TREM2基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增TREM2基因片段,將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至經(jīng)Age I酶切后的線性化GV358載體,轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)PCR方法鑒定正確后行DNA測(cè)序比對(duì)分析。將測(cè)序正確的重組慢病毒質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞進(jìn)行包裝并用熒光法行滴度測(cè)定。將成功包裝的過(guò)表達(dá)慢病毒感染小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞,Q-PCR檢測(cè)感染后細(xì)胞中TREM2 mRNA的表達(dá)水平。2.小鼠TREM2 shRNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定針對(duì)小鼠TREM2基因設(shè)計(jì)合成3對(duì)shRNA序列,將其分別連接至經(jīng)雙酶切后的線性化GV248載體,轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選出陽(yáng)性克隆后通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)行鑒定。將測(cè)序正確的重組慢病毒質(zhì)粒和包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞進(jìn)行包裝并用熒光法行滴度測(cè)定。將成功包裝的3種shRNA干擾慢病毒載體分別感染小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞,通過(guò)Q-PCR和Western blotting分別檢測(cè)感染后各組細(xì)胞中TREM2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果1.小鼠TREM2基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定通過(guò)PCR成功獲得TREM2基因片段并連接至線性化GV358載體上,通過(guò)PCR及DNA測(cè)序鑒定均證實(shí)重組慢病毒載體攜帶有正確的TREM2基因。在293T細(xì)胞中包裝獲得慢病毒并用熒光法測(cè)定其滴度為2.0×10~8 TU/mL。重組慢病毒載體感染小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后,Q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照慢病毒感染組相比,過(guò)表達(dá)慢病毒感染組細(xì)胞中T REM2基因mRNA的表達(dá)水平顯著升高(p0.05)。2.小鼠TREM2 shRNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定測(cè)序證實(shí)3種TREM2基因shRNA干擾慢病毒載體均構(gòu)建成功。在293T細(xì)胞中包裝獲得慢病毒并用熒光法測(cè)定病毒滴度分別為4×10~8 TU/mL、4×10~8 TU/mL和5×10~8 TU/mL。重組慢病毒載體感染小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后,Q-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照慢病毒感染組相比,3種TREM2基因shRNA干擾慢病毒感染組細(xì)胞中TRE M2基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平均下調(diào)(p0.05),其中GV248-shRNA-TR EM2-2感染組的沉默效率最佳,沉默效率達(dá)79.7%。結(jié)論我們利用慢病毒載體介導(dǎo)基因過(guò)表達(dá)以及RNA干擾的方法成功構(gòu)建了小鼠TREM2基因過(guò)表達(dá)和shRNA干擾慢病毒載體,并在小鼠BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中進(jìn)行鑒定,為揭示TREM2基因參與晚發(fā)型阿爾茨海默病(late-onse t Alzheimer's disease,LOAD)發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

GV358載體信息

TREM2 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝l electrophoresis of PCR amplification proV358 經(jīng) Age I 酶切后，，行瓊 1-3）。平板上挑取菌落做 PCR 鑒定克隆，載體大小與預(yù)期相符果的陽(yáng)性克隆行 DNA 測(cè)序分析
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2634032