發(fā)布時(shí)間：2019-11-13 03:40

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)是最為常見(jiàn)的引起老年癡呆的腦部神經(jīng)退行性疾病。但迄今為止，病因和發(fā)病機(jī)制仍不明確，提出了許多假說(shuō)。其中β淀粉樣蛋白(Amyloid β-protein,Aβ)級(jí)聯(lián)假說(shuō)占主導(dǎo)地位，認(rèn)為Aβ凝集和聚積是AD病理發(fā)生、發(fā)展的始動(dòng)因素和中心環(huán)節(jié)，可能是各種因素導(dǎo)致AD的共同途徑。因此圍繞Aβ展開(kāi)對(duì)AD發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中的各種影響因素及其調(diào)節(jié)的機(jī)制探討是目前研究的熱點(diǎn)。 鉛是環(huán)境中普遍存在的具有神經(jīng)毒性的重金屬。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育階段對(duì)鉛尤為敏感。人群流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)慢性職業(yè)鉛暴露和其他金屬接觸與阿爾茨海默癥、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥和精神分裂癥等有關(guān)。同時(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示發(fā)育早期鉛暴露是腦內(nèi)的淀粉樣變的危險(xiǎn)因素。可見(jiàn)鉛可能通過(guò)影響Aβ的代謝而導(dǎo)致AD樣病變。 因此研究運(yùn)用生命早期鉛暴露小鼠模型，探討早期鉛暴露引起的遲發(fā)神經(jīng)毒性效應(yīng)及鉛在AD樣變發(fā)生進(jìn)程中的作用，從而為AD的病因及發(fā)病機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。 目的 1建立生命早期鉛暴露動(dòng)物模型，應(yīng)用水迷宮實(shí)驗(yàn)，觀察增齡過(guò)程中小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化，從而為判定早期鉛暴露對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供依據(jù)。 2分析生命早期鉛暴露對(duì)不同月齡小鼠海馬組織β淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)基因、β-內(nèi)分泌酶1(β-secreatase-1,BACE1)、早老素-1(Presenilin-1,PS1)的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平的影響及海馬組織中Aβ的含量的變化，探討鉛暴露對(duì)淀粉樣蛋白生成的影響。 3評(píng)估鉛暴露對(duì)不同月齡小鼠海馬組織整體DNA甲基化水平及APP、PS1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)的影響，分析鉛暴露導(dǎo)致AD樣病變可能的分子機(jī)制，為鉛暴露神經(jīng)毒性分子機(jī)制和AD的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。 材料與方法 1研究對(duì)象 清潔級(jí)成年C57BL/6小鼠90只(雌60只，雄30只)，按雌:雄=2:1合籠飼養(yǎng)，以獲得孕鼠。孕鼠單籠飼養(yǎng)，待其分娩后取雄性仔鼠作為研究對(duì)象。仔鼠隨機(jī)分為4組，每組80只，分別是生長(zhǎng)發(fā)育期鉛暴露組(DP組)：孕鼠飲0.2%醋酸鉛水染毒后經(jīng)母乳給仔鼠染毒直至斷乳（21d）。成年期鉛暴露組(AP組)：仔鼠第6月齡開(kāi)始飲0.2%醋酸鉛水3個(gè)月。生長(zhǎng)期和成年期共同暴露組(DAP組)：孕鼠飲0.2%醋酸鉛水染毒后經(jīng)母乳給仔鼠染毒直至斷乳（21d）后，再至其第6月齡開(kāi)始飲0.2%醋酸鉛水3個(gè)月。對(duì)照組(C組)：給予無(wú)鉛去離子水。 2方法 2.1采用石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定小鼠血液、海馬組織鉛的含量。 2.2采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定1月齡、6月齡、12月齡、18月齡小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。 2.4采用Real-time PCR、Western blot技術(shù)分別檢測(cè)1月齡、6月齡、12月齡、18月齡小鼠海馬組織中APP、PS1、BACE1的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平。 2.3采用Elisa法檢測(cè)1月齡、6月齡、12月齡、18月齡小鼠海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42的含量。 2.5采用高效液相法檢測(cè)鉛暴露小鼠海馬組織中基因組DNA甲基化水平。 2.6采用MS-PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠海馬組織APP基因、PS1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)。 3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，Morris水迷宮中的逃避潛伏期用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析，其余變量用單因素方差分析，當(dāng)多組樣本均數(shù)間總體方差分析有差異時(shí)，組間兩兩比較用LSD法分析組間差異。相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為a=0.05。 結(jié)果 1生命早期鉛暴露對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響 1.1血鉛和海馬鉛含量測(cè)定結(jié)果顯示，1月齡和6月齡時(shí)，DP組和DAP組血鉛和海馬鉛水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)；12月齡和18月齡時(shí)，AP組和DAP組染毒結(jié)束，血鉛和海馬鉛水平增高，DP組、AP組和DAP組與C組相比，，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。 1.2水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1月齡和6月齡時(shí)，DP組和DAP組小鼠第三天至第五天的逃避潛伏期均較C組和AP組長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。12月齡和18月齡時(shí)，AP組和DAP組染毒結(jié)束，與C組比，鉛暴露各組小鼠第三天至第五天的逃避潛伏期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P 0.05)，DAP組逃避潛伏期最長(zhǎng)；鉛暴露各組跨越平臺(tái)次數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。 2生命早期鉛暴露對(duì)淀粉樣蛋白生成的影響 2.1Real-time PCR結(jié)果顯示APP、BACE1和PS1mRNA表達(dá)量在1、6月齡時(shí)DP組和DAP組與C組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)；在12月齡和18月齡時(shí)，DP組、AP組和DAP組均高于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。隨著年齡增長(zhǎng)， APP、BACE1和PS1mRNA在DP組、AP組和DAP組的表達(dá)量均逐漸升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。 2.2Western blot結(jié)果顯示，APP蛋白、BACE1蛋白和PS1蛋白表達(dá)量在12和18月齡時(shí)DP組AP組和DAP組均高于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。不同暴露組間APP蛋白、BACE1蛋白兩兩比較顯示，DP組與AP組，DP組與DAP組，AP組與DAP組表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。PS1蛋白在鉛暴露組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。隨著年齡增長(zhǎng)，DP組、AP組和DAP組的APP、BACE1、PS1蛋白表達(dá)量逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。 2.3不同組小鼠海馬組織Aβ1-40、Aβ1-42的含量結(jié)果顯示，1月齡和6月齡時(shí)， Aβ1-40、Aβ1-42的含量在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)；在12月齡和18月齡時(shí)，DP組、AP組和DAP組與C組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)，且隨著年齡的增長(zhǎng)而呈上升趨勢(shì)。 3生命早期鉛暴露對(duì)小鼠海馬組織基因組DNA甲基化水平的影響 3.1基因組DNA的甲基化水平比較結(jié)果顯示，不同組小鼠海馬組織基因組DNA的甲基化水平隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸降低；1月齡和6月齡時(shí)，DP組、DAP組與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)；12月齡時(shí)，DP組、AP組和DAP組與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)，DNA的甲基化水平分別降低1.2%、1.4%、2.0%；18月齡時(shí)，DP組、AP組和DAP組與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)，DNA的甲基化水平分別降低2.0%、1.5%、2.3%。呈低甲基化狀態(tài)。不同月齡小鼠海馬組織APP基因啟動(dòng)子甲基化水平在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)。鉛暴露組組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.01)。不同月齡小鼠海馬組織PS1基因啟動(dòng)子甲基化水平在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05)；不同鉛暴露組間兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。 結(jié)論 1生命早期鉛暴露可使小鼠血鉛和海馬鉛含量升高，后期排出較慢。 2生命早期鉛暴露能夠損傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，即便是在去除了鉛暴露這個(gè)危險(xiǎn)因素后也將持續(xù)存在學(xué)習(xí)記憶能力的損害。 3生命早期鉛暴露可造成小鼠大腦海馬組織中APP過(guò)度表達(dá)，同時(shí)海馬組織中BACE1、PS1的表達(dá)增高，而導(dǎo)致Aβ生成增多。 4鉛暴露可降低小鼠海馬組織基因組DNA的甲基化水平；APP基因、PS1基因啟動(dòng)子區(qū)呈低甲基化狀態(tài)。
【圖文】：

C 組 DP 組 AP 組 DAP 組圖 2.3 12 月齡小鼠尋找平臺(tái)的軌跡圖2.5.3.1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果本研究中 1 月齡、6 月齡、12 月齡和 18 月齡小鼠來(lái)自 4 個(gè)組，但在不同月齡隨機(jī)選擇 10 只進(jìn)行試驗(yàn)，而不是同一批小鼠，故試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析只考慮 1 月齡、6 月齡、12 月齡、18 月齡小鼠的分組因素和不同訓(xùn)練天數(shù)的變化情況。從表 2.3～2.6，用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析定位航行試驗(yàn)結(jié)果，各時(shí)間點(diǎn)之間的關(guān)系是否滿(mǎn)足 Huynh-Feldt 條件進(jìn)行球形檢驗(yàn)，結(jié)果為 P＞0.05，說(shuō)明重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)之間不存在相關(guān)性，滿(mǎn)足 Huynh-Feldt 條件，可用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的單變量方差分析處理資料，1 月齡時(shí)分組因素分析，各組 5d 內(nèi)的逃避潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.782，P=0.001)，相同時(shí)間點(diǎn)組間兩兩比較顯示從第三天開(kāi)始直至第五天，鉛暴露組小鼠逃避潛伏期高于 C 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6 月齡時(shí)各組 5d 內(nèi)的逃避潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=17.982，P=0.002)，同一月齡小鼠，組間兩兩比較結(jié)果顯示從第 3 天開(kāi)始直至第 5 天，鉛暴露組小鼠逃避潛伏期高于 C 組，

注：經(jīng)ANOVA，與同一月齡對(duì)照組比較，*P<0.05，鉛暴露組內(nèi)，與DP 組比圖 2.4 不同組各月齡小鼠穿越平臺(tái)位置的次數(shù)變化趨勢(shì)2.5.4 體內(nèi)鉛含量和學(xué)習(xí)記憶能力之間的關(guān)系由表 2.8 可見(jiàn)各月齡小鼠水迷宮逃避潛伏期與血鉛和海馬鉛呈正越平臺(tái)位置的次數(shù)呈負(fù)相關(guān)。表 2.7 小鼠血鉛和海馬鉛與空間學(xué)習(xí)記憶能力指標(biāo)之間的相關(guān)性分血鉛含量 海馬組織鉛r P r 逃避潛伏期 0.603 0.001 0.715 1 月齡穿越平臺(tái)次數(shù) -0.654 0.011 -0.654 逃避潛伏期 0.675 0.012 0.723 6 月齡穿越平臺(tái)次數(shù) -0.503 0.018 -0.772 逃避潛伏期 0.660 0.001 0.675
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2560109