【摘要】：研究背景最新研究表明,70歲以上的老年人群中有嚴重記憶力下降的老人占10%,而一半以上是由阿爾茲海默病(Alzheimer' s Disease,AD)引起的。照料一位晚期阿爾茲海默病患者的年費用約5~6萬美金,而且整個家庭及護理人員投入的精力和情感成本巨大,難以估量。阿爾茲海默病最早可以在30歲左右發(fā)病,但患病人群主要為60歲以上的老年人。患者主要表現(xiàn)為記憶力的逐年下降和認知功能損害的逐年加重。晚期阿爾茲海默病的典型磁共振表現(xiàn)為海馬和中顳葉的萎縮。鏡下阿爾茲海默病的典型病理表現(xiàn)為以β淀粉樣(β-Amyloid,Aβ)蛋白為核心和主要成分的老年斑(senile plaque,SP)和以過度磷酸化的tau蛋白為主要成分的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofilbrillary tangles,NFTs)以及皮層血管壁與軟腦膜中的Aβ的沉積。一些致病的基因突變和某些易感性基因的發(fā)現(xiàn)為加快認清阿爾茲海默病發(fā)病機制的進程提供了基礎(chǔ)。阿爾茲海默病在基因方面的主要危險因素是載脂蛋白E4(apolipoprotein ε4,Apo ε4)。攜帶一個載脂蛋白E4等位基因,患AD的風險將增加2~3倍;攜帶一對則風險增加16倍。在AD發(fā)病機制的所有學說中,形成最早、研究最成熟的是"淀粉樣蛋白假說"。該假說源于對AD的基因?qū)W模型,如唐氏綜合癥(Down Syndrome,DS)和A β對細胞的毒性。β淀粉樣蛋白是細胞正常代謝的產(chǎn)物,長度在36至43個氨基酸之間。Aβ40單體是淀粉樣蛋白中最常見的一種,而有自身聚集傾向的Aβ42危害性最大。β淀粉樣蛋白源自一種β分泌酶(β-secretase)BACE-1(β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1)和一種在催化核心含有presenilin 1的γ分泌酶(γ-secretase)復合體對淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)水解的產(chǎn)物。β淀粉樣蛋白的產(chǎn)生和清除的失衡及聚集造成了它在腦內(nèi)的沉積,這種過量β淀粉樣蛋白的沉積可能是AD的起始致病因素。BACE-2(β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1)是一種BACE-1的同源蛋白,兩種蛋白在結(jié)構(gòu)上的相似性很高,但是對APP的酶切位點不同。BACE-2的酶切位點位于A β 42的內(nèi)部,許多研究表明BACE-2可以減少細胞中A β 42的產(chǎn)生,所以BACE-2可以作為治療AD的一個靶點。微小 RNA(microRNAs,miRNAs)是小非編碼 RNA(small non-coding RNAs)的一種,長度多在22個核苷酸左右,在RNA介導的基因沉默中起引導作用。miRNA可以與目的mRNA的3'非翻譯區(qū)(3' untranslated region,3' UTR)通過堿基互補配對結(jié)合,然后降解目的mRNA使該基因的表達水平降低。miRNA在細胞中由兩種RNA聚合酶產(chǎn)生——Drosha和Dicer。miRNA作用廣泛,涉及動物和人類生長發(fā)育和疾病發(fā)展的各個方面,絕大多數(shù)編碼蛋白的mmRNA都可以為miRNA沉默。目前在人體中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 1000多種miRNA基因,而每一種miRNA能以幾百至幾千個不同的mRNA為目標。并且不同的miRNA相互協(xié)調(diào)地抑制彼此的表達。miRNA已經(jīng)在體內(nèi)組成了一個龐大、復雜而協(xié)調(diào)地基因調(diào)控網(wǎng)絡。miRNA的生成有著嚴格的時間和空間調(diào)控,miRNA的生成失調(diào)與人類的許多疾病有關(guān),例如神經(jīng)退行性疾病和腫瘤。早期的研究已經(jīng)表明,有些miRNA特異性地在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達,調(diào)控神經(jīng)元的分化、神經(jīng)突觸可塑性及神經(jīng)元突起的生長。多個研究通過profiling技術(shù)表明在AD患者的腦內(nèi)存在miRNAs的失調(diào)。miRNA在大腦灰質(zhì)中表達模式的異�？赡苁茿D發(fā)生的因素之一。某些miRNAs對腦內(nèi)A β生成過程中的關(guān)鍵酶有調(diào)控作用,可以減少A β在神經(jīng)元中的產(chǎn)生。綜上所述,miRNAs可能在治療AD方面有著巨大的潛力。研究目的本研究主要探討了在AD及其自然模型DS中miRNAs的作用,明確miRNA let-7c對BACE-2的調(diào)節(jié)作用,尋找用miRNAs治療AD的可能性。研究方法1.研究DS與AD發(fā)展過程中miRNA表達的變化1.1.提取DS模型細胞RNA,體外反轉(zhuǎn)錄得到細胞的cDNA,然后用Taqman Low density array檢測DS模型細胞系中miRNAs表達的變化,篩選出感興趣的miRNA。1.2.取DS與AD模型鼠的腦,提取腦組織RNA,做針對let-7c的qPCR觀察在兩種腦組織中l(wèi)et-7c表達量的變化。2.探索let-7c對β淀粉樣蛋白產(chǎn)生的影響2.1.培養(yǎng)穩(wěn)轉(zhuǎn)swAPP的HEK293細胞系(20E2),取培養(yǎng)基做ELISA檢測培養(yǎng)基中β淀粉樣蛋白的濃度;2.2.培養(yǎng)HEK293,分別用表達swAPP的質(zhì)粒pswAPP和表達C99的質(zhì)粒pC99轉(zhuǎn)染后用表達let-7c的質(zhì)粒pSuper-let-7c干預細胞。用ELISA檢測培養(yǎng)基中β淀粉樣蛋白酶的濃度;2.3.培養(yǎng)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的原代神經(jīng)元,用表達let-7c的腺相關(guān)病毒感染神經(jīng)元。用ELISA檢測原代神經(jīng)元培養(yǎng)基中β淀粉樣蛋白的濃度;3.明確let-7c對BACE-2活性的影響3.1.提取AD細胞模型2EB2(穩(wěn)轉(zhuǎn)了 BACE1和swAPP)蛋白做蛋白免疫印跡實驗觀察let-7c作用組與對照組C99和C83/80的變化;3.2.用表達C83的質(zhì)粒pC83轉(zhuǎn)染HEK293,在通過RNAi抑制BACE-2和NCT的情況下,再用let-7c干預細胞,提取蛋白做免疫印跡實驗,觀察C83表達的變化;4.Let-7c對BACE-2轉(zhuǎn)錄活動的調(diào)節(jié)4.1.用let-7c干預20E2細胞,提取細胞RNA做RT-PCR和qPCR觀察BACE-2表達量的變化;4.2.以pGL3-Basic為載體構(gòu)建包含BACE-2啟動子的質(zhì)粒pB2P1,轉(zhuǎn)染細胞后用let-7c干預,然后用雙熒光素分析實驗研究let-7c對BACE2啟動子的影響;5.Let-7c在BACE-2啟動子區(qū)作用位點的確定5.1.以pGL3-Basic為載體構(gòu)建一系列BACE-2啟動子的截短體轉(zhuǎn)染細胞,然后用let-7c干預,確定let-7c在BACE-2啟動子區(qū)作用位點的范圍;5.2.用Blast和Jaspar軟件確定let-7c在BACE-2啟動子區(qū)的作用位點;6.Ago2對BACE-2表達和活性的作用6.1.用siAgo2干預2EB2的情況下,再用let-7c干預該細胞。一部分細胞提取RNA做RT-PCR觀察BACE-2的表達變化;另一部分細胞提取蛋白做免疫印跡實驗觀察C99和C83/80在細胞中量的變化7.通過MTT實驗觀察let-7c對細胞增殖率的影響7.1.用let-7c干預2EB2細胞,通過MTT實驗分析細胞增殖率,觀察let-7c是否可以通過增加BACE-2的表達減少β淀粉樣蛋白的生成,從而增加細胞增殖率;研究結(jié)果1.Taqman Low density array 檢測到 DS 模型細胞中多種 miRNAs;1.1.DS模型細胞中有42種miRNA的表達與正常對照組相比發(fā)生了變化,其中l(wèi)et-7c是增高的;1.2.AD和DS小鼠模型腦內(nèi)let-7c的表達增高;2.Let-7c降低了細胞中β淀粉樣蛋白的產(chǎn)量;2.1.Let-7c組20E2培養(yǎng)基中的β淀粉樣蛋白濃度低于對照組;2.2.高表達swAPP和C99的HEK293在let-7c作用下培養(yǎng)基中的β淀粉樣蛋白的濃度低于對照組;2.3.APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠原代神經(jīng)元用pSuper-let-7c轉(zhuǎn)染后可以降低培養(yǎng)基中β淀粉樣蛋白的濃度;3.Let-7c增強了 BACE-2的作用3.1.用let-7c處理的2EB2細胞中C99的量降低,C83/80的量升高,說明let-7c可以增強BACE-2切割β淀粉樣蛋白的作用;3.2.用 siBACE-2 抑制 BACE-2 后,let-7c 增加 C83/80 的作用消失;4.Let-7c增加了 BACE-2的轉(zhuǎn)錄4.1.RT-PCR和qPCR的結(jié)果表明let-7c可以使BACE-2的mRNA表達量增加;4.2.雙熒光素酶實驗中高表達let-7c組的亮度高,說明let-7c可以使BACE-2的啟動子作用增強;5.在BACE-2的啟動子序列中存在let-7c的反應元件5.1.通過BACE-2啟動子截短體的雙熒光素酶實驗,我們確定了let-7c在BACE-2啟動子上的作用位點存在且在-1583~-646之間;5.2.Blast分析確定let-7c的反應元件位于-1370~-1342之間;6.下調(diào)Ago2可以減少BACE-2的轉(zhuǎn)錄,減弱BACE-2的作用6.1.在2EB2細胞中用siAgo2抑制Ago2的作用后再用let-7c干預,RT-PCR顯示BACE-2的轉(zhuǎn)錄減少,而且BACE-2增加細胞中C83/80量的作用也減弱甚至消失了,這說明Ago2參與了 let-7c激活BACE-2啟動子的過程;7.Let-7c可以增加2EB2細胞的增殖速率;7.1.MTT實驗結(jié)果為用let-7c干預的2EB2細胞的增殖要高于沒有用let-7c干預的細胞,let-7c通過降低β淀粉樣蛋白的產(chǎn)生使細胞的增殖率增加;結(jié)論1.在DS和AD的細胞和動物模型中miRNA let-7c的表達量增加;2.Let-7c可以激活BACE2基因;3.Let-7c可以減少β淀粉樣蛋白的生成;
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R749.16

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本文編號：2470749