【摘要】：目的：(1)利用全基因組DNA甲基化芯片(The Illumina Infinium Human Methylation450),檢測(cè)酒依賴(alcohol dependence, AD)患者及其未患病同胞全基因組水平DNA甲基化程度,篩選出兩者之間甲基化程度具有差異的位點(diǎn),探討這些差異性位點(diǎn)所在基因甲基化狀態(tài)和酒依賴之間的關(guān)聯(lián)。利用焦硫酸測(cè)序技術(shù),對(duì)某些甲基化程度差異性位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證分析,比較芯片結(jié)果與焦硫酸測(cè)序結(jié)果的相關(guān)性,增加可信度。(2)采用病例對(duì)照放大樣本量分析高差異程度基因,初步了解表觀遺傳在酒依賴病理機(jī)制中的作用和意義。 對(duì)象與方法：1.以精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四版(Diagnostic and Statistical Manual of mental disorder-Ⅳ, DSM-Ⅳ)軸I障礙定式臨床檢查(Structured Clinical Interview for DSM-IV Axis I Disorders, SCID-Ⅰ)為診斷標(biāo)準(zhǔn),將診斷為酒依賴者招募為病例組,并以酒精依賴性疾患識(shí)別測(cè)驗(yàn)量表(The Alcohol Use Disorders Identification Test, AUDIT)評(píng)定病例組酒依賴嚴(yán)重程度,應(yīng)用生活事件量表(LES)、 Wheatley應(yīng)激量表了解負(fù)性生活事件及出現(xiàn)酒依賴的可能應(yīng)激因素；以與病例組年齡、文化程度、地域相匹配的原則招募健康對(duì)照組；同時(shí),在知情同意的基礎(chǔ)上,選取酒依賴者家庭中一個(gè)尚未出現(xiàn)酒依賴(患病)狀態(tài)的同胞納入未患病同胞對(duì)組。本課題共招募兩組研究對(duì)象。一組是AD及未患病同胞對(duì)10對(duì),均為男性。另一組是病例組(63例)和健康對(duì)照組(65例),均為男性。所有入組研究對(duì)象均來(lái)自新鄉(xiāng)市市區(qū)及縣區(qū)。2.抽取所有研究對(duì)象外周靜脈抗凝血8～10ml,利用DNA提取試劑盒(Qiagen,德國(guó))提取各樣本基因組DNA,并對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸轉(zhuǎn)化處理及PCR擴(kuò)增。利用全基因組甲基化芯片(The Illumina Infinium Human Methylation450)對(duì)10對(duì)AD同胞對(duì)進(jìn)行基因組DNA甲基化檢測(cè)分析并得出原始數(shù)據(jù)。3.運(yùn)用BeadStudio Methylation Module v3.2軟件分析數(shù)據(jù)。甲基化程度的高低依據(jù)掃描回饋結(jié)果average Beta值(AVB,反映樣本CpG位點(diǎn)甲基化程度,數(shù)值越大,越趨近于1,甲基化程度越高),根據(jù)|DiffScore|≤20進(jìn)行甲基化程度差異性位點(diǎn)的篩選。4.通過(guò)焦硫酸測(cè)序技術(shù),利用10對(duì)同胞對(duì)(與全基因組DNA甲基化芯片檢測(cè)分析對(duì)象相同)外周血DNA,檢測(cè)GABRP、ALDH1L2、DBH、及GAD1基因甲基化程度,并與芯片結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析,觀察芯片結(jié)果與焦硫酸測(cè)序結(jié)果的相符情況,驗(yàn)證芯片技術(shù)的可靠性。5.運(yùn)用Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery6.7(DAVID; http://abcc.ncifcrf.gov)、Gene Ontology (GO; http://www.geneontology.org/)和the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; http://www. genome.jp/kegg/)對(duì)差異性位點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)通路分析。6.通過(guò)焦硫酸測(cè)序技術(shù),利用病例組(63例,不包括上述10對(duì)同胞對(duì)中的酒依賴患者)與健康對(duì)照組(65例)外周血DNA,對(duì)SSTR4基因和GABRP的差異性位點(diǎn)進(jìn)行甲基化狀態(tài)檢測(cè)分析,驗(yàn)證基于同胞對(duì)的分析結(jié)果。 結(jié)果：1.臨床研究(1)AD平均年齡為(44.9±5.9)歲,未患病同胞平均年齡為(44.2±7.2)歲,兩組年齡無(wú)顯著性差異(P0.05)。病例組年齡(39.1±7.3)歲,健康對(duì)照組年齡(39.6±8.1)歲,兩組年齡無(wú)顯著性差異(P0.05)。(2)10對(duì)酒依賴同胞對(duì)在AUDIT、 LES及Wheatley應(yīng)激量表評(píng)分的差異性均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,AUDIT (t=8.246, P0.05), LES (t=5.453, P0.05), Wheatley應(yīng)激量表(t=7.981,P0.05)。(3)63例酒依賴患者與65例健康對(duì)照在AUDIT. LES及Wheatley應(yīng)激量表評(píng)分的差異性均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,AUDIT (t=16.301, P0.05), LES (t=14.440, P0.05), Wheatley應(yīng)激量表(t=21.779,P0.05)。 2.10對(duì)酒依賴同胞對(duì)全基因組甲基化芯片檢測(cè)結(jié)果及驗(yàn)證 通過(guò)芯片檢測(cè)分析及結(jié)果分析,共有865個(gè)低甲基化位點(diǎn)和716個(gè)高甲基化位點(diǎn),這些位點(diǎn)涉及到827個(gè)已知基因。最高甲基化位點(diǎn)位于GABRP基因,最低甲基化位點(diǎn)位于SSTR4基因。10對(duì)同胞對(duì)焦硫酸測(cè)序結(jié)果與芯片結(jié)果相關(guān)性較好,GABRP基因、ALDH1L2、 GAD1及DBH基因的R2依次為：0.998,0.954,0.986,0.996,顯示芯片檢測(cè)結(jié)果可靠。 3.生物學(xué)通路分析 通過(guò)GO分析,這些差異性位點(diǎn)參與13條生物學(xué)過(guò)程、19條分子功能和20條分子構(gòu)成。通過(guò)KEGG分析,130個(gè)包含差異位點(diǎn)的基因中,33個(gè)基因?qū)儆诖x通路。 4、病例對(duì)照驗(yàn)證分析 病例組SSTR4基因與對(duì)照組SSTR4基因的甲基化程度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.723,P0.05),并且病例組SSTR4基因的CG%比例低于對(duì)照組。病例組GABRP基因與對(duì)照組GABRP基因的甲基化程度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=32.622,P0.05),并且病例組GABRP基因的CG%比例高于對(duì)照組。這與芯片結(jié)果相同,兩組方法的結(jié)果比較相符,相互驗(yàn)證。 結(jié)論：1.男性酒依賴患者與同胞對(duì)及健康對(duì)照相比,遭遇較多負(fù)性生活事件及有較高的應(yīng)激水平,說(shuō)明環(huán)境因素在酒依賴的形成與維持過(guò)程中起到一定作用。 2.男性酒依賴患者存在全基因組水平DNA甲基化異常,共有865個(gè)低甲基化位點(diǎn)和716個(gè)高甲基化位點(diǎn),這些位點(diǎn)涉及到827個(gè)已知基因。差異性甲基化位點(diǎn)參與了許多條生物學(xué)通路。DNA甲基化變化可能在酒精使用障礙病理機(jī)制中起到重要作用。 3.最高甲基化位點(diǎn)位于GABRP基因,最低甲基化位點(diǎn)位于SSTR4基因。SSTR4基因是新發(fā)現(xiàn)的可能與酒依賴相關(guān)的基因,它的甲基化程度的改變可能與酒依賴有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R749.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2422242