【摘要】：目的： 研究Caspr（Contactin associated protein）與β-淀粉樣前體蛋白（Amyloid PrecursorProtein，APP）之間的關系，探討Caspr抑制β-淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）產生的機制，揭示Caspr在阿爾茨海默病病理機制中可能發(fā)揮的作用。 方法： 利用免疫熒光技術（Immunofluorescence staining）觀察Caspr在APP/PS1老年癡呆模型小鼠腦內的分布情況；通過免疫印跡法（western blot）觀察Caspr在APP/PS1老年癡呆模型小鼠和同窩野生型小鼠腦內的蛋白表達情況；以穩(wěn)定表達印第安納突變的APP的HEK-293細胞(V717F，HEK-APP)和表達內源性APP的CHO細胞為研究對象，利用細胞轉染技術將質粒PCMV-Caspr-myc及它的空載體轉染進細胞中，通過免疫印跡法觀察細胞內APP的蛋白表達情況，并利用實時定量PCR（Quantitativereal-time PCR，qPCR）的方法檢測APP的mRNA表達情況；利用免疫熒光技術觀察Caspr和APP在細胞中和C57BL/6J成年小鼠（雄性）大腦皮層中的共定位情況；用免疫共沉淀法（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）研究Caspr和APP的相互作用關系；將質粒PCMV-Caspr-myc轉染進HEK-APP細胞中，，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）研究Caspr對APP的酶切產物Aβ（Aβ40和Aβ42）的影響；用MTT比色法檢測轉染Caspr后對細胞活性的影響。 結果： 免疫熒光法顯示，在APP/PS1老年癡呆模型小鼠的大腦皮層中，Caspr高度聚集在老年斑周圍；Western blot顯示，與對照組相比，Caspr在APP/PS1老年癡呆模型小鼠的大腦皮層中表達增加；Western blot和qPCR結果表明，在HEK-APP和CHO細胞中，過表達Caspr使APP蛋白的表達量下降，但并不影響APP的mRNA水平；通過免疫熒光技術發(fā)現(xiàn)，不論是在小鼠大腦皮層還是細胞系中，Caspr和APP都共定位于細胞膜上，并且Co-IP證實它們是有相互作用的；ELISA結果顯示，Caspr能抑制APP的酶切產物Aβ（Aβ40和Aβ42）的產生，但是Aβ42/Aβ40的比值不受影響；MTT比色法證實轉染Caspr后細胞活性并沒有受到明顯影響。 結論： 在APP/PS1模型小鼠皮層中，Caspr表達增加并聚集在老年斑周圍。Caspr與APP相互結合，Caspr通過轉錄后調控機制減少了APP蛋白的表達，并且抑制導致老年斑形成的Aβ的產生。由此，我們的研究發(fā)現(xiàn)Caspr參與了阿爾茨海默病病理機制，其有可能是治療AD的一個新的藥物靶點。
[Abstract]:Objective: to study the relationship between Caspr (Contactin associated protein) and 尾 -amyloid precursor protein (Amyloid PrecursorProtein,APP), and to explore the mechanism of Caspr inhibiting the production of 尾 -amyloid protein (A 尾). To reveal the role of Caspr in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Methods: the distribution of Caspr in the brain of APP/PS1 senile dementia mice was observed by immunofluorescence technique (Immunofluorescence staining). The expression of Caspr protein in the brain of APP/PS1 senile dementia mice and the same litter wild type mice was observed by Western blotting (western blot). HEK-293 cells (V717FnHEK-APP) expressing Indiana mutant APP and CHO cells expressing endogenous APP were used to transfect plasmid PCMV-Caspr-myc and its empty vector into the cells by cell transfection technique. The expression of APP protein was observed by Western blot and mRNA expression of APP was detected by real-time quantitative PCR (Quantitativereal-time PCR,qPCR). The co-localization of Caspr and APP in cells and cerebral cortex of adult C57BL/6J mice (male) was observed by immunofluorescence technique, and the interaction between Caspr and APP was studied by immunoprecipitation (Co-Immunoprecipitation,Co-IP). Plasmid PCMV-Caspr-myc was transfected into HEK-APP cells. The effect of Caspr on A 尾 (A 尾 40 and A 尾 42) of APP was studied by (ELISA), and the effect of Caspr transfection on cell activity was detected by MTT colorimetry. Results: immunofluorescence assay showed that in the cerebral cortex of APP/PS1 dementia mice, Caspr was highly concentrated around senile plaque. Western blot showed that the expression of Caspr was increased in the cerebral cortex of APP/PS1 senile dementia mice compared with the control group. The results of Western blot and qPCR showed that overexpression of Caspr in HEK-APP and CHO cells decreased the expression of APP protein, but did not affect the mRNA level of APP. Immunofluorescence technique showed that both Caspr and APP were located on the membrane of mouse cerebral cortex and cell line, and Co-IP confirmed that they interact with each other. The results of ELISA showed that Caspr could inhibit the production of A 尾 (A 尾 40 and A 尾 42), but the ratio of A 尾 42 / A 尾 40 was not affected, and the cell activity was not affected by MTT colorimetry. Conclusion: in the cortex of APP/PS1 model mice, the expression of Caspr increases and aggregates around the senile plaque. Caspr binds to APP and Caspr reduces the expression of APP protein through the mechanism of posttranscriptional regulation. And inhibit the production of A 尾, which leads to the formation of senile plaque. Therefore, our study found that Caspr is involved in the pathogenesis of Alzheimer's disease and may be a new drug target for the treatment of AD.
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R749.16

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本文編號：2414763