【摘要】：目的:1)研究減退的胰島素信號通路在阿爾茨海默病(AD)發(fā)病機制中的作用;2)研究艾塞那肽(Ex-4)的神經(jīng)保護機制。方法:1)取1、4、7、10月齡野生型C57BL/6小鼠和APP/PS1/Tau三重轉(zhuǎn)基因(3×Tg)小鼠進行實驗。分別分為正常對照(WT,Tg)組和2型糖尿病(WT+T2DM,Tg+T2DM)組。3個月建立T2DM模型成功后飼養(yǎng)2個月,各組小鼠生長為6、9、12、15月齡。通過體重、血糖檢測T2DM對機體代謝的影響;通過Morris水迷宮檢測減弱的胰島素信號對小鼠空間學習記憶能力的影響;通過ELISA檢測減弱的胰島素信號對轉(zhuǎn)入的人APP基因表達的腦內(nèi)A?42沉積的影響;通過Western blotting檢測減弱的胰島素信號對腦內(nèi)Tau、神經(jīng)絲(NFs)、胰島素受體底物(IRS)和PI3K/Akt/GSK-3β信號通路磷酸化水平的影響。2)取1、4、7、10月齡野生型C57BL/6小鼠和APP/PS1/Tau三重轉(zhuǎn)基因(3×Tg)小鼠進行實驗。分別分為正常對照(WT,Tg)組,艾塞那肽(WT+Ex-4,Tg+Ex-4)組,2型糖尿病(WT+T2DM,Tg+T2DM)組,2型糖尿病+艾塞那肽(WT+T2DM+Ex-4,Tg+T2DM+Ex-4)組。3個月造模成功后治療2個月,各組小鼠生長為6、9、12、15月齡。通過體重、空腹血糖、腹腔糖耐量、胰島素耐量檢測Ex-4對機體代謝的調(diào)節(jié)作用;通過Morris水迷宮檢測Ex-4對不同月齡小鼠空間學習記憶能力的影響;通過ELISA檢測Ex-4對A?42沉積的影響;通過Western blotting檢測Ex-4對Tau、NFs、IRS和PI3K/Akt/GSK-3β信號通路磷酸化水平的影響。3)以SH-SY5Y細胞為研究對象,用GLP-1受體激動劑Ex-4、低劑量PI3K抑制劑Wortmannin、GLP-1受體拮抗劑Ex9-39研究Ex-4的神經(jīng)保護機制,分為(Con)組,(Ex-4)組,(Ex-4+W)組,(W)組,(Ex-4+W+Ex9-39)組,(Ex9-39)組。通過MTT檢測Ex-4對低劑量wortmannin造成的細胞活力減低現(xiàn)象的保護作用;通過Western blotting檢測Tau、NFs、IRS和PI3K/Akt/GSK-3β信號通路磷酸化水平,分析Ex-4的神經(jīng)保護機制。結(jié)果:1)患T2DM的15月齡野生小鼠和6、9、12、15月齡3×Tg小鼠的平均逃避潛伏期較各自對照組延長,穿越隱匿平臺次數(shù)減少;野生小鼠沒有人APP基因,患T2DM的3×Tg小鼠腦內(nèi)轉(zhuǎn)入的人APP基因表達的A?42的沉積增多;T2DM組小鼠腦內(nèi)Tau蛋白和神經(jīng)絲蛋白磷酸化程度加重,IRS蛋白的磷酸化水平降低,PI3K/Akt/GSK-3β信號通路蛋白磷酸化水平降低。2)Ex-4能減輕高脂高糖飲食及T2DM造成的體重、空腹血糖的增加,減輕腹腔糖耐量和胰島素耐量受損程度,調(diào)節(jié)代謝改善小鼠胰島素抵抗的程度。Ex-4可改善減退的胰島素信號通路對15月齡野生小鼠的空間學習記憶能力的損傷程度及提高6、9、12月齡3×Tg小鼠的空間學習記憶能力,但對15月齡3×Tg小鼠的空間學習記憶能力的保護作用不明顯。Ex-4可減輕A?42的沉積,降低Tau、NFs的磷酸化水平,提高IRS及PI3K/Akt/GSK-3β信號通路蛋白的磷酸化水平。3)Wortmannin可抑制PI3K的磷酸化,Ex-4可以提高SH-SY5Y細胞活力,減少p-tau和p-NFs等AD樣病變,增加IRS的磷酸化水平,并減輕低劑量Wortmannin對PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的抑制。結(jié)論:減退的胰島素信號可能通過加重Aβ的沉積,使tau和NFs磷酸化增多,而加速AD的病理進程,而且Aβ、磷酸化的tau和NFs可能會進一步損傷IRS和PI3K信號通路,從而加重AD的癥狀。艾塞那肽能改善3×Tg小鼠的AD癥狀,減輕低劑量Wortmannin對SH-SY5Y細胞的損傷,其機制可能是通過激活GLP-1受體,進一步激活PI3K/Akt/GSK-3β信號通路,并能提高胰島素受體底物的磷酸化水平,改善胰島素抵抗,降低?淀粉樣蛋白的沉積,降低細胞骨架Tau蛋白和神經(jīng)絲的磷酸化水平,改善其功能,減少神經(jīng)毒性物質(zhì)的產(chǎn)生,從而減輕神經(jīng)退行性變的癥狀。
[Abstract]:Objective: 1) to study the role of the impaired insulin signaling pathway in the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD); 2) to study the neuroprotective mechanism of Ex-4 (1) to take 1,4,7,10 months old wild C57BL/6 mice and APP/PS1/Tau three heavy transgenic (3 x Tg) rats to be divided into normal control (WT, Tg) and type 2 diabetes mellitus (WT). +T2DM, Tg+T2DM) group.3 months established T2DM model after 2 months of success, mice in each group grew to 6,9,12,15 months. Blood glucose was used to detect the effect of T2DM on body metabolism through body weight; the effects of impaired insulin signals on the learning and memory ability of mice were detected by the Morris water maze, and the weakened insulin signal was transferred through ELISA detection. The effect of APP gene expression on A? 42 in the brain, and the effects of insulin signals weakened by Western blotting on Tau, nerve filament (NFs), insulin receptor substrate (IRS) and PI3K/Akt/GSK-3 beta pathway phosphorylation in the brain by Western blotting to take 1,4,7,10 month old wild type C57BL/6 mice and APP/PS1/Tau three transgenic mice (3 *) mice The experiments were carried out. They were divided into the normal control (WT, Tg) group, WT+Ex-4 (Tg+Ex-4) group, group 2 diabetes (WT+T2DM, Tg+T2DM), and the group of type 2 diabetes + Tg+T2DM+Ex-4 (Tg+T2DM+Ex-4) group for 2 months after.3 months, and the mice in each group grew to 6,9,12,15 months. The effects of Ex-4 on the metabolism of the body were detected; the effect of Ex-4 on the spatial learning and memory ability of mice of different months of age was detected by the Morris water maze; the effect of Ex-4 on the deposition of A? 42 was detected by ELISA; and the effects of Ex-4 on the phosphorylation level of Tau, NFs, IRS and beta signaling pathway were detected by Western blotting. GLP-1 receptor agonist Ex-4, low dose PI3K inhibitor Wortmannin, GLP-1 receptor antagonist Ex9-39 to study the neuroprotective mechanism of Ex-4, divided into (Con) group, (Ex-4+W) group, (W) group, (Ex-4+W+Ex9-39) group, (Ex-4+W+Ex9-39) group. Western blotting was used to detect the phosphorylation level of Tau, NFs, IRS and PI3K/Akt/GSK-3 beta signaling pathway, and the neuroprotective mechanism of Ex-4 was analyzed. Results: 1) the average escape latency of 15 month old wild T2DM mice and 6,9,12,15 month old 3 x Tg mice was longer than those of the control group, and the number of traversing hidden platforms decreased; there was no APP gene in wild mice and T2. The deposition of A? 42 in human APP gene expression in the brain of DM 3 * Tg mice increased; the degree of Tau protein and neurofilament phosphorylation in the brain of T2DM mice increased, the level of phosphorylation of IRS protein decreased, and the level of phosphorylation of PI3K/Akt/GSK-3 beta signaling protein decreased.2) Ex-4 can reduce the weight of high fat diet and T2DM, fasting blood glucose Increasing the degree of impaired glucose tolerance and insulin tolerance, and regulating the degree of metabolic improvement of insulin resistance in mice,.Ex-4 can improve the impairment of the impaired insulin signaling pathway to the spatial learning and memory ability of 15 month old wild mice and improve the spatial learning and memory ability of 6,9,12 month old 3 x Tg mice, but to 15 month old 3 x Tg. The protective effect of the spatial learning and memory ability of mice is not obvious.Ex-4 can reduce the deposition of A? 42, reduce the phosphorylation level of Tau, NFs, and increase the phosphorylation level of IRS and PI3K/Akt/GSK-3 beta signaling protein.3) Wortmannin can inhibit the phosphorylation of PI3K, Ex-4 can increase the activity of SH-SY5Y cells, reduce p-tau and other kinds of pathological changes. The level of phosphorylation and reducing the inhibition of the low dose of Wortmannin on the PI3K/Akt/GSK-3 beta signaling pathway. Conclusion: the reduced insulin signal may increase the phosphorylation of tau and NFs by aggravating the deposition of A beta and accelerating the pathological process of AD, and A beta, tau and NFs phosphorylated may further damage the IRS and PI3K signaling pathways, thereby aggravating AD. It can improve the AD symptoms of 3 x Tg mice and reduce the damage of low dose Wortmannin to SH-SY5Y cells. The mechanism may be to activate the GLP-1 receptor, further activate the PI3K/Akt/GSK-3 beta signaling pathway, and improve the phosphorylation level of the insulin receptor substrate, improve insulin resistance, and reduce the deposition of amyloid protein. Reducing the phosphorylation level of cytoskeletal Tau protein and neurofilament, improving its function, reducing the production of neurotoxic substances, thereby alleviated the symptoms of neurodegenerative changes.
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16

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本文編號：2152864