本文選題：死亡相關(guān)蛋白激酶1 + 阿爾茨海默病��； 參考：《華中科技大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：[背景] 阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)的兩大特征性病理改變?yōu)椋哼^度磷酸化的Tau蛋白在細胞內(nèi)的聚集形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs),和p-淀粉樣多肽(β-amyloid, Aβ)在細胞外的沉淀形成老年斑(senile plaques, SPs),導(dǎo)致神經(jīng)元的退化和功能缺失,出現(xiàn)漸進性記憶障礙、認知功能障礙、語言障礙及人格改變等癡呆癥狀。死亡相關(guān)蛋白激酶1(death-associated protein kinase1, DAPK1)是由鈣／鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的、可引起其底物在絲、蘇氨酸位點發(fā)生磷酸化修飾的蛋白激酶,它在腫瘤細胞表達減少,而在神經(jīng)退行性病變中表達增多,其作用是誘導(dǎo)細胞凋亡、自噬和壞死,并在信號傳導(dǎo)、腫瘤的發(fā)生發(fā)展和神經(jīng)退行性病變中起重要作用。用全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study, GWAS)和單核苷酸多態(tài)分析(gene-centric single nucleotide polymorphisms, SNP)研究證明DAPK1的表達與遲發(fā)型阿爾茨海默病密切相關(guān)。本課題組研究發(fā)現(xiàn),Tau蛋白磷酸化能夠?qū)雇庠葱缘牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)的凋亡,從而最終導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生退行性變。但Tau蛋白磷酸化能否對抗腦內(nèi)內(nèi)源性凋亡誘導(dǎo)因子如DAPK1誘導(dǎo)的細胞凋亡,目前尚不清楚。 [目的] 探討DAPK1對Tau蛋白磷酸化的作用及Tau蛋白磷酸化在DAPK1誘導(dǎo)的細胞凋亡中的作用。 [方法] 實驗選取10月齡C57小鼠、hTau小鼠及Tg2576小鼠,分離皮層和海馬等腦組織,用Western Bolt方法檢測DAPK1和Tau蛋白在各組織中的表達；用免疫組化觀察DAPK1及AD相關(guān)磷酸化位點在皮層和海馬中的分布。 分別用HEK293/wt、N2a和HEK293/tau細胞轉(zhuǎn)染wtDAPK、siDAPK、mutant DAPK1、siMARK2質(zhì)粒48小時,或24小時后采用無血清誘導(dǎo)細胞凋亡,采用免疫組織化學(xué)或免疫印跡檢測Tau蛋白磷酸化、磷酸酯酶或蛋白激酶的活性及凋亡蛋白的表達水平；采用CCK8檢測細胞活性,Hochest和TUENL染色檢測細胞凋亡情況；采用免疫共沉淀檢測DAPK1和Tau蛋白的相互作用；采用細胞免疫熒光的方法檢測DAPK1和Tau蛋白共定位情況。 [結(jié)果] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)hTau轉(zhuǎn)基因小鼠腦片DAPK1的表達量和正常C57小鼠相比明顯升高,并且表達部位也由突起和細胞膜轉(zhuǎn)入胞漿。通過無血清誘導(dǎo)凋亡的方式使DAPK1激活,發(fā)現(xiàn)無論細胞的活性還是凋亡因子的表達以及細胞核固縮等指標,Tau蛋白的過表達可明顯改善細胞凋亡。HEK293/Tau細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染wtDAPK1質(zhì)�；騭iDAPK1質(zhì)粒后,可調(diào)節(jié)Tau蛋白的Thr231, Ser262和Ser396位點磷酸化水平。與Thr231, Ser262和Ser396位點磷酸化有關(guān)的蛋白激酶和磷酸酯酶：PP2A, GSK-3β、PKA、CaMKⅡ、Cdc2、Cdk5和MARK2,不涉及DAPK1誘導(dǎo)的Tau蛋白磷酸化的機制中。采用免疫共沉淀方法,發(fā)現(xiàn)Tau和DAPK1可以形成復(fù)合體；免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)DAPK1與總Tau(Tau-5或R134d)和pT231在細胞膜上有共定位。用kinase區(qū)缺失的突變DAPK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEN293/Tau細胞后,發(fā)現(xiàn)pT231,pS262和pS396水平?jīng)]有改變。 [結(jié)論] DAPK1可以通過磷酸化Tau蛋白的Thr231,Ser262和Ser396位點,而對抗其誘導(dǎo)的細胞凋亡。
[Abstract]:Background background

The expression of protein kinase 1 ( DAPK1 ) , which is regulated by calcium / calcium modulated protein , can induce apoptosis , autophagy and necrosis of neurons . It also plays an important role in the development of apoptosis , cognitive dysfunction , language disorder and personality change . The death - associated protein kinase 1 ( death - associated protein kinase1 , DAPK1 ) is a protein kinase which can induce apoptosis , autophagy and necrosis .

Purpose of the project

To investigate the role of DAPK1 on Tau protein phosphorylation and the role of Tau protein phosphorylation in DAPK1 - induced apoptosis .

Methodology

The expression of DAPK1 and Tau protein in various tissues was determined by Western Bolt method in the brain tissues of 10 - month - old C57 mice , hTau mice and Tg2576 mice , isolated cortex and hippocampus .
The distribution of DAPK1 and AD - related phosphorylation sites in cortex and hippocampus was observed by immunohistochemistry .

The activity of Tau protein phosphorylation , phosphatase or protein kinase activity and the level of apoptosis protein were detected by immunohistochemistry or Western blot after transfection of pAPK , siDAPK , mutant DAPK1 , siMARK2 plasmid for 48 hours , or 24 hours respectively .
The apoptosis of the cells was detected by the cell activity , Hochest and TUENL staining .
The interaction of DAPK1 and Tau protein was detected by immunoconjugate precipitation .
Cell immunofluorescence was used to detect the co - localization of DAPK1 and Tau protein .

The result is not valid .

The results showed that the expression of DAPK1 was significantly higher in hTau transgenic mice than in normal C57 mice .
Immunofluorescence staining showed that DAPK1 was co - located with Tau - 5 or R134d and pT231 on the cell membrane . After transfection of HEN293 / Tau cells with the mutant DAPK1 plasmid , the level of pT231 , pS262 and pS396 was not changed .

Conclusion

DAPK1 can counter its induced apoptosis by phosphorylating the Thr 231 , Ser262 and Ser396 sites of Tau protein .
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R749.16

【共引文獻】

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本文編號：2108076