本文選題：阿爾茨海默病 + tau蛋白�。� 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病,其主要病理變化是細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)和細(xì)胞外淀粉樣老年斑(senile plaques, SP)。臨床病理研究發(fā)現(xiàn),AD患者的癡呆癥狀嚴(yán)重程度與腦組織中的NFTs數(shù)量呈正相關(guān),NFTs的主要蛋白成分為過度磷酸化的tau蛋白。 Tau蛋白是神經(jīng)細(xì)胞中的微管相關(guān)蛋白,其生理功能為促進(jìn)微管組裝和穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu),tau蛋白過度磷酸化過后失去上述生物學(xué)功能,并且自身聚合形成雙螺旋絲和NFTs,導(dǎo)致神經(jīng)元微管破壞、胞體-軸突營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸及信息傳遞障礙和神經(jīng)元退化死亡。引起tau蛋白異常過度磷酸化的機(jī)制是蛋白激酶活性升高和/或磷酸酯酶活性下降,研究顯示cAMP-依賴性蛋白激酶A (cAMP-dependent protein kinase, PKA)在tau蛋白異常過度磷酸化中起重要作用。Forskolin為PKA特異性激動(dòng)劑,在體內(nèi)激活PKA后,可以直接磷酸化tau從而產(chǎn)生過度磷酸化的tau蛋白,被PKA預(yù)磷酸化的tau蛋白更易被糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)和周期蛋白依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase5, CDK5)磷酸化。 神經(jīng)元重新進(jìn)入細(xì)胞周期是AD主要的神經(jīng)病理學(xué)特征之一。中樞神經(jīng)元通常被認(rèn)為處于終末分化狀態(tài),意味著它們不再進(jìn)入細(xì)胞周期。然而,越來(lái)越多的研究顯示AD患者腦中的神經(jīng)元存在細(xì)胞周期的重新進(jìn)入,重新進(jìn)入細(xì)胞周期將導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。AD腦中含有NFTs的神經(jīng)元存在細(xì)胞周期調(diào)控因子(cyclin B、PCNA和Cdc2等)的異常表達(dá)與激活,cyclin D1是調(diào)節(jié)神經(jīng)元離開G0期進(jìn)入G1期的關(guān)鍵分子,AD患者腦中其水平升高,表明AD腦中含有NFTs的神經(jīng)元存在細(xì)胞周期的重新進(jìn)入,提示了tau蛋白過度磷酸化與神經(jīng)元重新進(jìn)入細(xì)胞周期之間可能的內(nèi)在聯(lián)系。 第一部分Forskolin誘導(dǎo)培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元tau蛋白過度磷酸化 (一)目的探討Forskolin誘導(dǎo)的原代海馬神經(jīng)元tau蛋白過度磷酸化。 (二)材料與方法本部分研究以培養(yǎng)的新生1天SD大鼠原代海馬神經(jīng)元為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,使用4μmol/L cAMP-依賴性蛋白激酶A (cAMP-dependent protein kinase, PKA)的特異性激動(dòng)劑Forskolin分別處理原代海馬神經(jīng)元Oh、3h、6h、12h和24h,用免疫印跡和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)在上述不同時(shí)間點(diǎn)上tau蛋白Ser214、Ser396及Ser202/Thr205位點(diǎn)的磷酸化水平。用Image J圖像分析軟件對(duì)免疫印跡結(jié)果進(jìn)行灰度分析,用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),用LSD法對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次用于統(tǒng)計(jì)分析,即樣本量為3。 (三)結(jié)果新生1天SD大鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)48h,用4μmol/L Forskolin處理0h、3h、6h、12h和24h,進(jìn)行免疫印跡和免疫熒光檢測(cè)原代海馬神經(jīng)元tau蛋白的磷酸化水平,結(jié)果顯示：tau蛋白Ser214位點(diǎn)的磷酸化在Forskolin作用6h和12h升高,其中6h時(shí)tau蛋白的磷酸化達(dá)到高峰(F=10.059,P0.005),24h下降至0h水平；tau蛋白Ser396位點(diǎn)的磷酸化在Forskolin作用6h時(shí)升高(F=4.813,P0.05),12h時(shí)達(dá)到高峰(F=4.813,P0.005),24h時(shí)降至0h水平；tau蛋白Ser202/Thr205位點(diǎn)的磷酸化在Forskolin作用3h、6h、12h和24h時(shí)均升高,其中12h時(shí)tau蛋白的磷酸化達(dá)到高峰(F=2.720,P0.005),24h時(shí)下降至3h水平；Forskolin作用0h、3h、6h、12h和24h的總tau蛋白水平之間沒有差異(F=0.720, P0.05); Ser214. Ser396和Ser202/Thr205位點(diǎn)磷酸化的tau和總tau均主要分布在胞質(zhì)。 (四)結(jié)論4μmol/L Forskolin誘導(dǎo)培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元tau蛋白在Ser214、Ser396和Ser202/Thr205位點(diǎn)過度磷酸化,其磷酸化高峰分別為Forskolin作用6h、12h和12h。 第二部分Tau蛋白過度磷酸化的同時(shí)神經(jīng)元重新進(jìn)入細(xì)胞周期 (一)目的探討tau蛋白過度磷酸化與神經(jīng)元重新進(jìn)入細(xì)胞周期的關(guān)系。 (二)材料與方法本部分研究以培養(yǎng)的新生1天SD大鼠原代海馬神經(jīng)元為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,用4μmol/L cAMP-依賴性蛋白激酶A (cAMP-dependent protein kinase, PKA)的特異性激動(dòng)劑Forskolin處理原代海馬神經(jīng)元誘導(dǎo)tau蛋白過度磷酸化,采用免疫印跡法檢測(cè)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclinB1,采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)原代海馬神經(jīng)元Ser214、Ser396和Ser202/Thr205位點(diǎn)過度磷酸化的tau蛋白與細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的共定位。用Image J圖像分析軟件對(duì)免疫印跡結(jié)果進(jìn)行灰度分析,用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),用LSD法對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次用于統(tǒng)計(jì)分析,即樣本量為3。 (三)結(jié)果新生1天SD大鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)48h,用4μmol/L Forskolin處理6h和12h誘導(dǎo)tau蛋白過度磷酸化,應(yīng)用DMSO作為溶劑對(duì)照,進(jìn)行免疫印跡,檢測(cè)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclinB1,結(jié)果顯示：在4μmol/L Forskolin作用6h和12h,原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞周期蛋白cyclinD1和cyclin B1的水平均升高(cyclin D1:F=433.106, P0.005; cyclin B1: F=39.135, P0.005)。新生1天SD大鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)48h,用4μmol/L Forskolin處理6h誘導(dǎo)tau蛋白過度磷酸化,進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo),檢測(cè)Ser214位點(diǎn)過度磷酸化的tau蛋白與細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的共定位,結(jié)果顯示：4μmol/L Forskolin處理6h, tau蛋白Ser214位點(diǎn)的磷酸化水平增高,細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1水平均升高,Ser214位點(diǎn)過度磷酸化的tau蛋白與細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1存在共定位,Ser214位點(diǎn)過度磷酸化的tau蛋白和細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1均主要分布在胞質(zhì)。新生1天SD大鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)48h,用4μmol/L Forskolin處理12h誘導(dǎo)tau蛋白過度磷酸化,進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo),分別檢測(cè)Ser396和Ser202/Thr205位點(diǎn)過度磷酸化的tau蛋白與細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的共定位,結(jié)果顯示：4μmol/L Forskolin處理12h, tau蛋白Ser396和Ser202/Thr205位點(diǎn)的磷酸化水平均增高,細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1水平均升高,Ser396和Ser202/Thr205位點(diǎn)過度磷酸化的tau蛋白與細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1均存在共定位,Ser396和Ser202/Thr2O5位點(diǎn)過度磷酸化的tau蛋白以及細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1均主要分布在胞質(zhì)。 (四)結(jié)論4μmol/L Forskolin誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元tau蛋白過度磷酸化的同時(shí),細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1水平均升高,過度磷酸化的tau蛋白與細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1存在共定位。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R749.16

【參考文獻(xiàn)】

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1 張軍霞;王s，

本文編號(hào)：1759143