本文選題：阿爾茨海默病　切入點：14-3-3β/ζ　出處：《華中科技大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景：PP2A活性下降導致tau過度磷酸化,進而促進神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFTs)形成,是阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。核蛋白SET是體內(nèi)PP2A特異、高效的抑制劑,主要分布在嗅球、海馬、大腦皮質(zhì)、尾殼核、丘腦等腦區(qū)。AD患者經(jīng)免疫化學檢測發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)SET表達水平明顯增高,而且細胞定位也從細胞核轉(zhuǎn)至細胞漿,并且發(fā)現(xiàn)SET共定位于神經(jīng)元胞漿內(nèi)PP2A及過度磷酸化的tau蛋白。前期研究發(fā)現(xiàn)：過表達SET導致大鼠PP2A活性顯著降低,tau異常過度磷酸化,神經(jīng)元退變,甚至出現(xiàn)AD患者樣運動功能障礙的表現(xiàn)。上述研究結(jié)果說明：作為PP2A上游調(diào)節(jié)因子,SET在AD腦內(nèi)自核轉(zhuǎn)運并滯留于胞漿聚集是引起AD發(fā)病的一個非常關(guān)鍵的因素。因此,明確AD腦內(nèi)SET核運輸?shù)木唧w機理將有助于詮釋AD的發(fā)病機制。然而SET如何轉(zhuǎn)運并聚積于胞漿內(nèi),以及PP2A活性被SET所抑制的具體分子機制尚不清楚。我們前期針對SET核運輸相關(guān)的核定位信號(Nuclear localization signal, NLS)序列展開了相應(yīng)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Ser-9位點磷酸化失活SET核定位信號,造成核輸入蛋白不能正常結(jié)合SET,導致SET滯留胞漿。然而,AD患者腦內(nèi)SET Ser-9磷酸化的分子機制及其它可能致SET滯留胞漿聚集的機制有待進一步明確。14-3-3蛋白作為接頭／支架蛋白與其他蛋白質(zhì)結(jié)合,廣泛參與了細胞凋亡、細胞分裂、信號轉(zhuǎn)導、蛋白跨膜轉(zhuǎn)運等重要生命活動的調(diào)節(jié)進程。近來更多的研究揭示了14-3-3蛋白在核運輸中的調(diào)控作用。比如Cdc25蛋白的Ser-216被磷酸化后可以與14-3-3ε結(jié)合形成Cdc25/14-3-3s復(fù)合物,并導致Cdc25不能結(jié)合importina正常進入到細胞核中,類似的還有RSG, HDAC4蛋白等。這些研究均提示：14-3-3蛋白對于核-漿穿梭蛋白的核輸入具有負調(diào)作用。同時,14-3-3β/ζ在AD患者腦內(nèi)過表達,存在于NTFs中,與AD患病進程正相關(guān)。這些研究提示：14-3-3β/ζ蛋白參與了AD的病理過程,但具體機制不明。具有核輸入負調(diào)作用的14-3-3蛋白與其靶蛋白結(jié)合存在識別序列RX1-2SX2-3S(X代表基本氨基酸),通過篩選SET的全長,我們發(fā)現(xiàn)其1‘‘NESGDPSSKST156序列,符合14-3-3蛋白識別序列RX1-2SX2-3S,提示：14-3-3蛋白可能通過結(jié)合SET導致其滯留胞漿,抑制PP2A活性,參與AD發(fā)病。本研究證實：14-3-3通過與核輸入蛋白importina競爭性結(jié)合SET,導致核輸入復(fù)合物形成障礙,SET入核困難而滯留胞漿,進而引起AD下游病理事件。 目的：探討過表達14-3-3β/ζ對SET核運輸障礙的影響及其潛在的分子機制,為AD藥物開發(fā)提供有效的分子靶點。 方法：培養(yǎng)HEK293/tau細胞,轉(zhuǎn)染表達14-3-3β/ζ48h后通過共聚焦／雙光子顯微鏡和WB檢測SET的亞細胞分布。通過Co-IP方法檢測過表達14-3-3β/ζ組SET與14-3-3β/ζ及核輸入蛋白Importina的結(jié)合程度。通過篩選SET全長,我們發(fā)現(xiàn)其146NESGDPSSKST156序列,符合14-3-3蛋白識別序列RX1-2SX2-3S,為此,合成具有穿膜和透血腦屏障功能的純化Tat肽段Tat-NESGDPSSKST(Peptide1),和亂序序列作為對照的Tat肽段Tat-NSSTEDGPKSS(Peptide2)。在HEK293/tau細胞轉(zhuǎn)染表達14-3-3ζ的同時加入人工合成并純化Tat肽段,48h后通過共聚焦／雙光子顯微鏡和WB檢測SET的亞細胞分布。通過Co-IP方法檢測加入Peptide1/2組是否影響SET與14-3-3p/ζ及核輸入蛋白Importina的結(jié)合。通過PP2A活性檢測試劑盒(Promega, Cat.#V2460)測定過表達14-3-3β/ξ及Peptide1/2干預(yù)后對PP2A活性的影響。利用免疫印跡方法檢測過表達14-3-3β/ζ,SET,14-3-3β/ζ+SET后對tau蛋白Ser199, Ser202, Thr205,Thr231,Ser262,Ser396和Ser404位點磷酸化程度的影響；人工包裝過表達14-3-3ζ的腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV),通過腺相關(guān)投遞系統(tǒng)感染C57小鼠,分別用Peptide1/2干預(yù),進一步明確SET與14-3-3蛋白的結(jié)合序列NESGDPSSKST,確定其可能成為促進SET入核的小分子肽,為AD有些藥物開發(fā)提供候選分子靶點。通過條件恐懼實驗,水迷宮實驗來檢測行為學的變化,激光共聚集熒光顯微鏡下觀察腦片上SET蛋白的亞細胞定位。64位陣列系統(tǒng)檢測活體腦片海馬DG區(qū)到CA1區(qū)LTP變化,體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元檢測神經(jīng)元樹突,樹突棘等的變化,免疫印跡實驗檢測小鼠海馬synaptotagmin,synaptophysin, synapsin1, phosphorylated synapsin1(p-synapsin1), NR1, NR2A和NR2B等突觸蛋白及SET Ser-9磷酸化的變化。 結(jié)果：在HEK293/tau細胞株中,分別過表達14-3-3β/ζ導致大部分SET自核轉(zhuǎn)運并滯留于胞漿。分別分離提取胞漿及胞核蛋白后,發(fā)現(xiàn)過表達14-3-3β/ζ組細胞核內(nèi)的SET蛋白量明顯減少,而在胞漿中明顯增加；通過免疫共沉淀方法檢測到過表達14-3-3β/ζ；后SET與importina結(jié)合減少導致SET核輸入障礙。我們還觀察到在轉(zhuǎn)染了14-3-3ζ的HEK293/tau細胞株中,用Peptide1處理導致SET正常轉(zhuǎn)運到細胞核中。利用核蛋白提取試劑盒分離提取胞漿與胞核蛋白,發(fā)現(xiàn)核蛋白中Peptide1處理組的SET量明顯增高,而在胞漿蛋白中明顯減少；通過免疫共沉淀方法檢測到Peptide1處理組SET與importina結(jié)合隨劑量逐漸增加。我們還觀察到過表達14-3-3β/ζ后顯著抑制PP2A活性,并導致tau蛋白在Ser199, Ser202, Thr205, Thr231, Ser262, Ser396和Ser404位點發(fā)生過度磷酸化,Peptide1處理可恢復(fù)PP2A活性。進一步在小鼠海馬齒狀回(Dentategyrus,DG)定位注射AAV8-14-3-3ζ病毒感染動物,并用Peptide1/2干預(yù),發(fā)現(xiàn)過表達14-3-3ζ后,小鼠情景恐懼實驗和水迷宮實驗均表現(xiàn)學習和記憶的障礙,而Peptide1處理可以有效恢復(fù)。激光共聚集熒光顯微鏡下觀察到腦片中不同區(qū)域Peptide1可以恢復(fù)過表達14-3-3ζ引起的SET胞漿滯留現(xiàn)象。64位陣列系統(tǒng)檢測活體腦片海馬DG區(qū)到CA1區(qū)LTP變化,發(fā)現(xiàn)過表達14-3-3ζ可以顯著抑制LTP,而Peptide1處理可以有效恢復(fù),體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)過表達14-3-3ζ可導致神經(jīng)元樹突長度縮短,分支減少,樹突棘密度減少等變化,而Peptide1處理可以有效恢復(fù),免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)在小鼠海馬蛋白中,過表達14-3-3ζ可導致synaptotagmin,synaptophysin,synapsin1,phosphorylated synapsin1(p-synapsin1)等突觸前蛋白減少,NR2A：NR2B比值變大,SET Ser-9,顯著磷酸化,Peptide1處理可以有效恢復(fù)上述變化。 結(jié)論：14-3-3β/ζ可以通過與SET蛋白的HESGDPSSKST序列結(jié)合,導致SET與importina結(jié)合顯著減少,從而引起SET核輸入障礙,滯留胞漿,顯著抑制PP2A活性,并導致tau蛋白發(fā)生過度磷酸化,神經(jīng)元樹突損傷,LTP及學習和記憶的損傷。通過給予Tat-NESGDPSSKST肽段可以通過有效競爭性結(jié)合14-3-3β/ζ來釋放SET,使SET核輸入正常而主要定位與胞核,減少對胞漿中PP2A的抑制,恢復(fù)PP2A活性,減少神經(jīng)元樹突損傷,恢復(fù)LTP及學習和記憶的損傷等。 背景：第一部分研究發(fā)現(xiàn)過表達14-3-3ζ導致SET滯留在胞漿,并伴有SET Ser-9磷酸化現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn)SET上游蛋白激酶CKⅡ在AD腦內(nèi)上調(diào),二聚體的14-3-3ζ可募集CKⅡ。為此,我們設(shè)想：14-3-3ζ在結(jié)合SET的同時,也俘獲CKⅡ,從而使得SET更容易成為CKⅡ的底物被磷酸化,進一步引起磷酸化SET與importina結(jié)合障礙,導致SET滯留胞漿。 目的：探討14-3-3ζ與CKⅡ介導SET滯留胞漿的分子機制,進一步闡明AD發(fā)病機制。 方法：通過海馬DG區(qū)注射AAV8-14-3-3ζ病毒,感染C57小鼠,激光共聚集熒光顯微鏡下觀察腦片SET的亞細胞定位,以及SET、14-3-3ξ及CKⅡα的分布與共定位。培養(yǎng)HEK293/tau細胞,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+/14-3-3ζ48h后,通過免疫共沉淀方法檢測SET、14-3-3ζ及CKⅡα的結(jié)合程度。使用CKⅡ特異性抑制劑TBB(4,5,6,7-Tetrabromobenzotriazole)處理轉(zhuǎn)染14-3-3ζ的HEK293/tau細胞,檢測SET Ser-9磷酸化變化,SET表達量變化,CKⅡα表達量變化。已轉(zhuǎn)染CKⅡα的HEK293/tau細胞給予sil4-3-3ζ處理,檢測SET Ser-9磷酸化變化,SET表達量變化,CKⅡα表達量變化。通過絲氨酸／蘇氨酸檢測試劑盒(Promega,Cat.#V2460)測定PP2A活性。人工包裝過表達CKⅡα的AAV病毒感染C57小鼠,同時分別用AAV8-si14-3-3ζ、AAV8-Ssi處理。通過條件恐懼實驗,水迷宮實驗來檢測行為學的變化,激光共聚集熒光顯微鏡下觀察腦片上SET蛋白的亞細胞定位。64位陣列系統(tǒng)檢測活體腦片海馬DG區(qū)到CA1區(qū)LTP變化,體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元檢測神經(jīng)元樹突,樹突棘等的變化,免疫印跡檢測小鼠海馬synaptotagmin, synaptophysin, synapsin1,phosphorylated synapsin1O-synapsin1),NRl, NR2A和NR2B等突觸蛋白及SET Ser-9磷酸化的變化。 結(jié)果：過表達14-3-3ζ的AAV8病毒感染C57小鼠腦片上,我們可以觀察到SET、CKⅡα、14-3-3ζ三者間可相互共定位,且過表達14-3-3ζ動物腦內(nèi)SET主要定位于胞漿。在HEK293/tau細胞株中,免疫共沉淀結(jié)果顯示SET、CKⅡα、14-3-3ζ三者間相互結(jié)合,且過表達14-3-3ζ組的結(jié)合程度顯著增強。這些結(jié)果提示：14-3-3在結(jié)合SET的同時,也可募集CKⅡα。已轉(zhuǎn)染14-3-3ζ的HEK293/tau細胞給予CKⅡ抑制劑TBB處理后發(fā)現(xiàn),SET Ser-9磷酸化程度顯著降低；給予si14-3-3ζ處理后發(fā)現(xiàn),敲減14-3-3ζ可導致SETSer-9磷酸化程度降低。說明CKⅡα通過14-3-3ζ的募集促進對SET的磷酸化修飾。PP2A活性檢測發(fā)現(xiàn)TBB處理可很好的恢復(fù)由于14-3-3ζ引起的PP2A活性降低。人工包裝過表達CKIIa的AAV8病毒感染C57小鼠,同時分別用AAV8-si14-3-3ξ、AAV8-Ssi處理,條件恐懼、水迷宮實驗實驗發(fā)現(xiàn)si14-3-3ξ處理可恢復(fù)小鼠學習和記憶能力。激光共聚集熒光顯微鏡下可觀察到過表達CKⅡα可促進SET滯留于胞漿,而si14-3-3ζ可恢復(fù)SET的核輸入。64位陣列系統(tǒng)檢測活體腦片海馬DG區(qū)到CA1區(qū)LTP變化,發(fā)現(xiàn)過表達CKⅡα可以顯著抑制LTP,體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)過表達CKⅡα可導致神經(jīng)元樹突長度縮短,分支減少,樹突棘密度減少等變化；免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)在小鼠海馬蛋白中,過表達CKⅡα可導致synaptotagmin, synaptophysin, synapsin1, phosphorylated synapsin1(p-synapsin1)等突觸前蛋白減少,NR2A：NR2B比值變大,SET Ser-9顯著磷酸化,si14-3-3ζ處理可以有效恢復(fù)上述變化。 結(jié)論：14-3-3ζ可同時結(jié)合CKⅡα與SET,并促進CKⅡα對SET Ser-9的磷酸化,進一步導致SET滯留胞漿,引起PP2A活性抑制、神經(jīng)元樹突損傷、學習和記憶的損傷。si14-3-3ζ顯著減少CKⅡα與SET的結(jié)合,引起CKⅡ磷酸化SET Ser-9程度降低,從而恢復(fù)PP2A活性、神經(jīng)元樹突損傷、學習和記憶的損傷。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16

【共引文獻】

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本文編號：1556900