本文關(guān)鍵詞： 嘌呤霉素敏感的氨肽酶(PSA/NPEPPS) 神經(jīng)細(xì)胞 Aβ25-35 細(xì)胞凋亡 caspase-3　出處：《山東大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景 阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease,AD),又稱老年癡呆,是老年人群癡呆的最常見(jiàn)、最重要的類型。臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性的記憶力減退,認(rèn)知功能障礙等癥狀。其患病率隨年齡增加而增高,隨著我國(guó)及世界人口結(jié)構(gòu)日益趨向老齡化,AD的發(fā)病率逐年上升,嚴(yán)重危害老年人的身心健康和生活質(zhì)量,給病人造成巨大的痛苦,給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān),已成為嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題,引起了普遍關(guān)注。 阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前對(duì)其治療也沒(méi)有行之有效的方法。研究顯示疾病的發(fā)生與其病理學(xué)改變有關(guān),其特征性病理改變主要表現(xiàn)為：神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)、細(xì)胞外老年斑或神經(jīng)炎性斑(senile plaque,SP)的形成及神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)度凋亡。神經(jīng)纖維纏結(jié)主要由高度磷酸化的Tau蛋白沉積所致：老年斑則主要是由β淀粉樣肽(βamyloid peptide, Aβ)沉積引起的,并進(jìn)一步引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡 嘌呤霉素敏感的氨肽酶(puromycin-sensitive aminopeptidase PSA/NPEPPS)是一種廣泛分布的金屬氨肽酶,在腦中含量很豐富。Cons tam等研究發(fā)現(xiàn)PSA具有蛋白水解作用,在有絲分裂期與紡錘體微管的形成有關(guān),并且PSA的抑制劑能引起細(xì)胞的凋亡。此外PSA對(duì)于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、主要組織相容性復(fù)合物I(MHC I)的處理、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育都有重要作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)PSA可以降解Tau蛋白,改善AD的癥狀,為以Tau蛋白為靶標(biāo)治療AD提供了新思路——Tau蛋白降解劑。作為AD病理學(xué)改變之一的Aβ沉積,與Tau蛋白異常過(guò)度磷酸化及神經(jīng)細(xì)胞的凋亡密切相關(guān),但是Aβ與PSA之間的關(guān)系卻很少有人研究。本研究試圖探討Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡與PSA之間的關(guān)系。 目的 在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)沉默PSA表達(dá)、PC12細(xì)胞內(nèi)上調(diào)PSA表達(dá)的基礎(chǔ)上,加入Aβ25-35誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,研究PSA對(duì)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響,進(jìn)一步探討PSA作為一種潛在的AD治療藥物的分子機(jī)制。 方法 1.采用MTT法、Hoechst染色檢測(cè)不同濃度(0、10、20、30μmol/L)的Aβ25-35對(duì)SH-SY5Y、PC12細(xì)胞的影響：MTT法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；Hoechst染色檢測(cè)對(duì)細(xì)胞核形態(tài)的影響,從而確定最佳濃度的Aβ25-35來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。 2.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在SH-SY5Y細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PSA-siRNA,在PC12細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PSA重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染24h后,加20μmol/L的Aβ25-35處理細(xì)胞。SH-SY5Y細(xì)胞分組為：A：NC組,B:NC+Aβ25-35組,C:PSA-siRNA組,D:PSA-siRNA+Aβ25-35組； PC12細(xì)胞分組為： E：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組,F：空質(zhì)粒+Aβ25-35組,G：PSA過(guò)表達(dá)組,H：PSA過(guò)表達(dá)+Aβ25-35組。加入Aβ25-35作用24h后收集各組細(xì)胞,(a)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；(b)Western blot檢測(cè)PSA、caspase-3蛋白的表達(dá)情況；(c)酶標(biāo)儀檢測(cè)caspase-3活性。 結(jié)果 1.Aβ25-35抑制SH-SY5Y細(xì)胞、PC12細(xì)胞增殖,細(xì)胞核發(fā)生細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變,確定20μmol/L的Aβ25-35作用24h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)； 2.在SH-SY5Y細(xì)胞中,沉默PSA表達(dá)能使Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率升高,促進(jìn)caspase-3酶原激活,caspase-3活性升高。反之,在PC12細(xì)胞過(guò)表達(dá)PSA能使Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率下降,抑制caspase-3酶原激活,caspase一3活性降低。 結(jié)論 Aβ25-35能抑制神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng),引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡,最佳作用濃度為20μmol/L:PSA能抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡,對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與抑制caspase-3通路的激活有關(guān)。
[Abstract]:Background Alzheimer ' s disease ( AD ) , also known as senile dementia , is the most common and most important type of dementia in the elderly . The prevalence of AD increases with age . With the aging of the population structure of our country and the world , the incidence of AD rises year by year . The pathogenesis of Alzheimer ' s disease is not clear , and there is no effective method for the treatment of Alzheimer ' s disease . The study shows that the occurrence of the disease is related to its pathological changes . The characteristic pathological changes are mainly caused by the formation of neurofibrotangles ( NFT ) , extracellular senile plaques or neuroinflammatory plaques ( SP ) and the excessive apoptosis of nerve cells . Puromycin - sensitive PSA / NPEPPS is widely distributed in the brain . It has been found that PSA has proteolytic action , which is related to the formation of spindle microtubules during mitosis . In recent years , it has been found that PSA can degrade Tau protein and improve AD . In recent years , it has been found that PSA can degrade Tau protein and improve AD . Purpose To investigate the effect of PSA on the apoptosis of PC12 cells induced by A尾25 - 35 and to further study the molecular mechanism of PSA as a potential drug for AD treatment . method 1 . The effects of A尾25 - 35 of different concentrations ( 0 , 10 , 20 , 30 渭mol / L ) on cell growth were determined by MTT assay . 2 . The PSA - siRNA was transiently transfected into the cells by liposome transfection . The cells were transiently transfected with PSA - siRNA in PC12 cells . After 24 h of transfection , the cells were treated with 20 渭mol / L of A尾25 - 35 . The groups were : A : NC group , B : NC + A尾25 - 35 group , C : PSA - siRNA group , D : PSA - siRNA + A尾25 - 35 group ; PC12 cells were grouped into E : empty plasmid transfection group , F : empty plasmid + A尾25 - 35 group , G : PSA overexpression group , H : PSA overexpression + A尾25 - 35 group . After 24 h of the addition of A尾25 - 35 , group cells were collected , ( a ) flow cytometry was performed to detect cell apoptosis rate ; ( b ) Western blot was used to detect the expression of PSA and caspase - 3 protein ; ( c ) caspase - 3 activity was detected by microplate reader . Results 1.A尾25 - 35 inhibited the proliferation of PC12 cells , the morphological changes of cell apoptosis in PC12 cells , and determined that 20 渭mol / L of A尾25 - 35 was used for 24h . 2 . The apoptosis rate of A尾25 - 35 induced by A尾25 - 35 was increased and caspase - 3 activity was increased . On the contrary , the apoptosis rate induced by A尾25 - 35 was decreased and caspase - 3 activity was inhibited and caspase - 3 activity was decreased in PC12 cells . Conclusion A尾25 - 35 can inhibit the growth of nerve cells , induce apoptosis of nerve cells , and the optimal concentration is 20 渭mol / L : PSA can inhibit the apoptosis of nerve cells induced by A尾25 - 35 . It has protective effect on neurons , and its mechanism may be related to the inhibition of caspase - 3 pathway activation .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：1549077