本文關(guān)鍵詞：硫酸酯酶抑制劑DU-14拮抗淀粉樣β蛋白神經(jīng)毒性的行為學及電生理研究

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【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)即老年性癡呆癥,是一種發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性、原發(fā)性、漸進性、不可逆性的退行性變,常表現(xiàn)為認知功能障礙、精神行為異常和生活能力下降。AD的典型病理特征為腦內(nèi)出現(xiàn)以淀粉樣p蛋白(myloid β protein, Aβ)為核心的老年斑、磷酸化tau蛋白(Phosphorylated tau protein, P-tau)為主要成分的神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)元的丟失。 目前,關(guān)于AD的發(fā)病機制存在眾多假說,諸如Aβ級聯(lián)假說、tau蛋白假說、氧化應激假說、神經(jīng)炎性假說、鈣平衡自體失衡假說、膽堿能假說及興奮毒假說等,其中Ap級聯(lián)假說被廣泛認可。Aβ作為老年斑的核心成分,已被證明具有較強的神經(jīng)毒性,其在AD患者腦內(nèi)(尤其是海馬內(nèi))沉積而引起細胞鈣超載、膽堿能系統(tǒng)損害、突觸數(shù)目減少及神經(jīng)元變性死亡是AD患者出現(xiàn)認知功能障礙的主要病因。 神經(jīng)甾體(neurosteroid)是神經(jīng)系統(tǒng)中(主要是腦內(nèi))以膽固醇為底物,經(jīng)相關(guān)酶催化合成的甾體類物質(zhì)。神經(jīng)甾體主要包括脫氫表雄酮(Dehydroepiandrosterone, DHEA)及其硫酸酯(Dehydroepiandrosterone sulfate, DHEAS)、孕烯醇酮及其硫酸酯、孕酮及別孕烯醇酮等。神經(jīng)甾體在腦、血漿及腎上腺中的水平往往隨年齡增高而減低,與此同時常伴發(fā)年齡相關(guān)的神經(jīng)功能障礙及神經(jīng)退行性變,諸如AD、帕金森病、C型尼曼—匹克病等。這提示神經(jīng)甾體作為內(nèi)源性神經(jīng)保護因子能夠使神經(jīng)元免受有毒物質(zhì)的損傷。近年研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)甾體尤其是DHEAS與AD等神經(jīng)退行性疾病存在密切相關(guān)性。AD患者下丘腦常出現(xiàn)DHEAS的減低伴P-tau的增多,紋狀體和小腦中出現(xiàn)DHEAS減低伴Ap的增多。DHEAS與這些構(gòu)成神經(jīng)原纖維纏結(jié)和老年斑的關(guān)鍵蛋白的相關(guān)性提示,腦內(nèi)DHEAS在AD的病理進程中具有極其重要的作用,其水平的減低可能與AD發(fā)病有關(guān)。另外,研究還證明,DHEAS能夠拮抗NMDA介導的興奮毒性、促進乙酰膽堿(ACh)的釋放并有效地抑制由Ap引起的鈣超載。 一般情況下,DHEA及DHEAS在腦內(nèi)含量隨年齡增高而逐漸減低,但AD患者腦內(nèi)特別是海馬及顳葉皮層中DHEA水平顯著增高,而同時DHEAS水平則出現(xiàn)下降。據(jù)此推測,AD患者腦內(nèi)的DHEA與DHEAS的轉(zhuǎn)化存在異常。鑒于DHEAS可被甾體硫酸酯酶作用脫去硫酸基團轉(zhuǎn)化為單體形式的DHEA,我們提出假設：通過使用硫酸酯酶抑制劑DU-14抑制硫酸酯酶的活性可以提高腦內(nèi)DHEAS水平,有可能拮抗Aβ引起的神經(jīng)毒性傷害,改善學習記憶功能、神經(jīng)元網(wǎng)絡電活動及突觸可塑性。 本研究通過雙側(cè)海馬注射Aβ1-42建立AD的動物模型,借助Morris水迷宮試驗、在體海馬局部場電位(local field potential, LFP)和在體海馬突觸長時程增強(long term potentiation, LTP)記錄等實驗手段,通過析因設計觀察DU-14是否能夠拮抗由Aβ1-42引起的大鼠空間學習記憶、神經(jīng)網(wǎng)絡電活動以及突觸可塑性的損害,旨在探討DHEAS的神經(jīng)保護作用并為AD預防治療藥物的研發(fā)提供新的思路。 研究主要包括以下內(nèi)容：(1)利用Morris水迷宮試驗觀察海馬注射Ap1-42是否可以導致大鼠空間學習記憶能力的損傷,DU-14是否能夠有效拮抗由Aβ1-42導致的這一損傷；(2)行為學實驗結(jié)束后,觀察同一批實驗動物海馬神經(jīng)網(wǎng)絡振蕩活動,探討DU-14是否能夠拮抗Aβ1-42造成Theta節(jié)律異常；(3)利用在體海馬突觸長時程增強記錄技術(shù),觀察Aβ1-42對海馬突觸可塑性的影響,并探討DU-14是否能夠拮抗Aβ1-42引起的長時程增強的壓抑。 第一部分DU-14拮抗Ap1-42導致的大鼠空間學習記憶損傷 目的：探討Aβ1-42引起的大鼠空間學習記憶能力損傷能否被DU-14預處理所拮抗。 方法：選取運動功能正常、無視力障礙的健康成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(180g～220g),隨機分成四組:vehicle+saline組,DU-14+saline組,vehicle+Aβ組及DU-14+Aβ組。將大鼠麻醉后,在三維腦立體定位儀引導下,將藥物用微量注射泵緩慢注射到雙側(cè)海馬CAl區(qū)�？p合手術(shù)創(chuàng)口,待其清醒并恢復兩周后,進行Morris水迷宮試驗。本試驗由三部分組成：定位航行試驗,用以評估空間學習能力；空間探索試驗,用以評估空間記憶能力；可視平臺試驗,用以排除大鼠的運動和視力障礙。主要觀察指標為各組大鼠的逃避潛伏期、在目標象限游泳時間百分比及平均游泳速度。 結(jié)果：(1)定位航行試驗顯示,在第1～5天中隨著訓練天數(shù)的推移,各組大鼠找到水下平臺的潛伏期明顯縮短,反映了大鼠的空間學習過程。在第2～5訓練日的同一天內(nèi),vehicle+Aβ組大鼠找到水下平臺的潛伏期明顯長于vehicle+saline組(P0.001);而DU-14+Aβ組大鼠的逃避潛伏期明顯低于vehicle+Aβ組(P0.001)。(2)空間探索試驗顯示,在撤除水下平臺后,vehicle+Aβ組大鼠在目標象限(原平臺所在象限)的游泳時間百分比明顯小于vehicle+saline組(P0.001)；而DU-14+Aβ組大鼠在目標象限游泳時間的百分比明顯較vehicle+Aβ組高(P0.001)。(3)可視平臺實驗顯示,各處理組間大鼠平均游泳速度及到達可視平臺的潛伏期均沒有明顯差異(P0.05)。 結(jié)論：雙側(cè)海馬注射Aβl-42可嚴重損傷大鼠的空間學習及記憶能力,而DU-14預處理可以有效拮抗Aβ1-42所致大鼠空間學習記憶能力的損害。該部分實驗結(jié)果初步提示,神經(jīng)甾體硫酸酯酶抑制劑DU-14具有神經(jīng)保護作用,可能在改善AD患者認知功能中發(fā)揮有益作用。 第二部分DU-14拮抗Aβ1-42對大鼠海馬theta節(jié)律的抑制 目的：觀察Aβ1-42對海馬神經(jīng)網(wǎng)絡振蕩活動的影響,探討DU-14預處理是否可拮抗Aβ1-42對大鼠海馬CAl區(qū)theta節(jié)律的抑制作用。 方法：Morris水迷宮試驗后的次日,經(jīng)烏拉坦適度麻醉后,分別對四組大鼠進行在體海馬局部場電位theta節(jié)律的誘導和記錄。 結(jié)果：(1)雙側(cè)海馬注射DU-14及Aβ1-42對海馬CAl區(qū)theta節(jié)律功率峰對應的頻率值無明顯影響。夾尾刺激后,vehicle+saline組,vehicle+Aβ組,DU-14+saline組及DU-14+Aβ組四組大鼠誘導出theta節(jié)律功率峰對應的頻率值分別是3.26±0.05Hz,3.19±0.04Hz,3.21±0.07Hz,3.10±0.05Hz,無統(tǒng)計學差異(P0.05)。(2)雙側(cè)海馬注射Aβ1-42可明顯壓抑海馬CAl區(qū)theta節(jié)律功率峰值,單獨注射DU-14對海馬CAl區(qū)theta節(jié)律功率峰值無影響,但DU-14可有效拮抗Aβ1-42對大鼠海馬CAl區(qū)theta節(jié)律功率的抑制作用。對夾尾后誘導的theta節(jié)律進行功率譜分析,發(fā)現(xiàn)vehicle+Aβ組大鼠海馬CAl區(qū)theta節(jié)律的功率峰值為22.29±0.78dB,明顯低于vehicle+saline組的28.78±1.10dB(P0.001)；而DU-14+Aβ組功率峰值為25.61±0.90dB,明顯高于vehicle+Aβ組(P0.01)。 結(jié)論：雙側(cè)海馬注射DU-14和Aβ1-42對由夾尾誘導的theta節(jié)律功率峰對應的頻率值沒有明顯的影響, Aβ1-42可顯著壓抑海馬theta節(jié)律的功率峰值,而DU-14能夠有效拮抗Aβ1-42對海馬theta節(jié)律功率的抑制作用。初步提示,DU-14可通過拮抗Aβ1-42的神經(jīng)毒性,緩解Aβ1-42對神經(jīng)網(wǎng)絡振蕩活動的損害。 第三部分DU-14拮抗Aβ1-42引起的大鼠海馬LTP壓抑 目的：觀察DU-14及Aβ1-42對大鼠海馬CAl區(qū)突觸可塑性長時程增強的影響,從突觸可塑性角度探討DU-14拮抗Aβ1-42神經(jīng)毒性的電生理學機制。 方法：完成在體海馬局部場電位記錄之后,在腦立體定位儀的精確引導下,將自制的平行綁定電極(同心圓雙極刺激電極與單極記錄電極進行綁定)插入到背側(cè)海馬,通過刺激海馬schaffer側(cè)支,在CAl區(qū)放射層記錄場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)。選擇I/O曲線上50～65%最大fEPSP對應的刺激強度的單個脈沖刺激來誘發(fā)和記錄基礎fEPSP；至少穩(wěn)定記錄基礎fEPSP30分鐘后,通過雙脈沖刺激誘發(fā)、記錄雙脈沖易化(paired pulse facilitation,PPF);最后通過三組高頻刺激(high frequency stimulation,HFS)誘導LTP,刺激強度為I/O曲線上75～85%最大fEPSP對應的刺激強度；在HFS刺激后恢復單脈沖刺激,刺激強度同誘發(fā)基礎fEPSP的刺激強度,至少記錄60分鐘。 結(jié)果：(1)雙側(cè)海馬注射DU-14及Ap1-42對海馬CAl區(qū)PPF無明顯影響,在給予雙脈沖刺激之后,vehicle+saline組、vehicle+Aβ組、DU-14+saline組及DU-14+Aβ組四組大鼠的fEPSP2/fEPSPl的值分別為165.5±5.9%、160.6±5.5%、158.3±5.8%、169.7±6.9%,各組之間無顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。(2)海馬注射Aβ1-42顯著抑制了HFS誘導的在體海馬CAl區(qū)的LTP,高頻刺激后即刻,vehicle+Aβ組LTP誘導值為135.2±2.9%,明顯低于vehicle+saline組的187.3±7.1%(P0.001)；同時海馬注射Aβ1-42也顯著抑制了LTP的維持,高頻刺激60分鐘后,vehicle+Aβ組LTP維持在128.2±3.1%,明顯低于vehicle+saline組的146.0±3.9%(P0.01)。(3)海馬單獨注射DU-14對LTP沒有明顯影響,但DU-14可以顯著拮抗Ap1-42對LTP的壓抑作用。高頻刺激后即刻,DU-14+Aβ組的LTP值為173.4±4.8%,明顯高于vehicle+Aβ組的135.2±2.9%(P0.001)；在高頻刺激后60分鐘時,DU-14+Aβ組的LTP維持在143.9±4.2%,明顯高于vehicle+Aβ組的128.2±3.1%(P0.01)。 結(jié)論：海馬注射Aβ1-42可以明顯壓抑在體海馬CAl區(qū)LTP的誘導和維持,而對PPF無影響,說明其對LTP的壓抑主要是通過突觸后機制而非影響突觸前的遞質(zhì)釋放。DU-14處理可以有效拮抗Aβ1-42對LTP的壓抑效應,提示在突觸層面上,DU-14具有神經(jīng)保護作用,可以使得突觸聯(lián)系和可塑性免受Aβ1-42的損傷。該部分研究結(jié)果與神經(jīng)網(wǎng)絡振蕩活動及行為學的結(jié)果保持一致,可以從細胞、神經(jīng)網(wǎng)絡、整體三個不同層面充分證實DU-14的神經(jīng)保護作用。 總之,本研究在同一批動物模型上,使用Morris水迷宮試驗及在體場電位記錄等多種技術(shù)手段,從不同層面證實了DU-14對Aβ1-42神經(jīng)毒性具有拮抗作用,并初步探討了這一作用可能涉及到的電生理機制。本研究為DU-14等神經(jīng)硫酸酯酶抑制劑用于AD的預防或治療提供了初步的實驗依據(jù)。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

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1 劉曉杰;楊威;祁金順;;氧化應激與阿爾茨海默病[J];生理學報;2012年01期

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本文編號：1295164