本文關鍵詞：Furin和NPAS4對阿爾茨海默病的神經保護作用及機制研究

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【摘要】：背景:阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常見的神經退行性疾病,其主要神經病理學特征包括細胞外神經炎性斑(senile plagues,SPs,又稱老年斑)、細胞內神經元纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)以及由此造成的神經元和神經突觸的缺失。AD的病因及其發(fā)病過程仍未徹底闡明,但目前已確定Aβ沉積是老年斑的主要成分,而tau蛋白過度磷酸化導致神經元纖維纏結。神經生長因子(NGF)已用來治療AD并進入II期臨床試驗。而研究發(fā)現(xiàn)介導NGF由前體NGF轉化而來的Furin在AD腦中也降低。Furin是一種前體蛋白轉化酶,它還催化腦源性神經生長因子(BDNF)前體和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的成熟。這表明Furin在AD發(fā)病中的作用可能遠大于NGF。目的:本研究(1)通過建立穩(wěn)定表達Furin的神經元細胞系,分析Furin與細胞凋亡、內質網應激之間的關系以及Furin對Abeta代謝的影響;(2)通過真核表達質粒NPAS4轉染原代神經元,分析NPAS4與tau蛋白清除之間的關系,基本解明Furin和NPAS4在AD病理環(huán)節(jié)中的作用及機制,為篩選治療AD的靶分子奠定基礎。方法:神經元細胞系sh-sy5y轉染furin后經過篩選建立穩(wěn)定表達furin的細胞系,然后采用免疫印跡(westernblot,wb)方法檢測自噬、凋亡、內質網應激及其abeta代謝相關分子。通過真核表達質粒npas4轉染原代神經元,采用免疫熒光(immunofluorescence,if)和免疫印跡(westernblot,wb)方法分析自噬相關分子的變化及其tau蛋白表達情況,然后用自噬藥物處理細胞后wb檢測tau蛋白變化。結果:(1)furin過表達能誘導自噬、保護氧化應激誘導的凋亡、抑制內質網應激。我們還發(fā)現(xiàn),在穩(wěn)定表達furin的細胞中,ire1α的磷酸化顯著增加,在h2o2和tunicamycin存在時更加明顯。但perk、atf6的變化不顯著,提示furin選擇性激活了ire1α,但這一現(xiàn)象還需要動物實驗驗證。(2)jnk和erk是ire1α的下游分子,ire1α在ers時獨立促進了依賴于jnk的自噬,且這種作用只依賴于ire1α的激酶活性,而與ire1α的內切酶活性無關。結果提示ire1α可能是通過jnk/erk調節(jié)自噬的。因此我們推測furin促進自噬的作用可能與ire1α-jnk/erk通路有關。(3)furin能影響app代謝酶類和減少aβ產生。根據以上結果我們推測:furin一方面通過bdnf促進神經元樹突生長和學習和記憶,并對抗氧化應激損傷和凋亡;另一方面furin通過ire1α-自噬途徑,以及通過影響adam10/ps1活性,最終減輕aβ沉積,從而改善ad的認知障礙。(4)npas4過表達誘導神經元自噬。cq處理后lc3-ii和p62蛋白水平增加比npas4組更明顯,說明npas4能誘導自噬通量。(5)自噬抑制(3-ma或cq)或誘導(血清饑餓)后,我們發(fā)現(xiàn),血清饑餓誘導的自噬降低了內源性總的和磷酸化tau蛋白水平,在NPAS4過表達時這一現(xiàn)象更加明顯。3-MA或CQ處理后內源性總的和磷酸化tau蛋白均升高,但是NPAS4過表達反轉了它的提高。這些結果表明自噬活性提高對tau蛋白的清除是有益的。(6)我們用MG132抑制UPS后發(fā)現(xiàn)tau清除被抑制,同時MG132并沒有影響自噬(LC3-II沒變),暗示出NPAS4可能通過一個未知的UPS機制清除tau蛋白。(7)NPAS4并沒有影響使tau磷酸化的激酶。結論:Furin一方面通過BDNF促進神經元樹突生長和學習和記憶,并對抗氧化應激損傷和凋亡;另一方面Furin通過IRE1α-自噬途徑,以及通過影響ADAM10/PS1活性,最終減輕Aβ沉積,從而改善AD的認知障礙。NPAS4過表達能誘導自噬并降低內源性tau表達,且這一機制由自噬介導。Tau蛋白尤其是磷酸化tau蛋白的清除對于治療AD等tau病具有重要意義。因此本研究的發(fā)現(xiàn)可能對于神經退行性疾病的治療提供新的思路。
【關鍵詞】：Furin NPAS4 阿爾茨海默病 細胞凋亡 自噬
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-19
• 第一部分Furin對阿爾茨海默病神經保護作用及機制研究19-45
• 1 材料與方法20-27
• 2 結果27-33
• 3 討論33-37
• 參考文獻37-45
• 第二部分NPAS4對阿爾茨海默病神經保護作用及機制研究45-68
• 1 材料與方法45-50
• 2 結果50-62
• 3 討論62-65
• 參考文獻65-68
• 全文總結68-69
• 文獻綜述一 前體蛋白轉化酶家族的重要成員----弗林蛋白酶69-79
• 參考文獻75-79
• 文獻綜述二 阿爾茨海默病治療的新分子靶標79-96
• 參考文獻87-96
• 致謝96-97
• 個人簡歷和攻讀學位期間的研究成果97

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