發(fā)布時間：2017-09-15 15:09

  本文關(guān)鍵詞：人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離鑒定及向肝臟樣細(xì)胞分化的實驗研究

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【摘要】：目的探討人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、鑒定及向肝臟樣細(xì)胞分化的方法。 方法將脂肪組織切成小于1mm3的碎片，用膠原酶Ⅰ消化離心法獲得人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，然后以1×104/cm2的細(xì)胞濃度，接種于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中,置于培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)；觀察原代細(xì)胞形態(tài)及生長情況；取第5代細(xì)胞接種于24孔板中，每天消化3個孔，計算細(xì)胞數(shù)量，取其平均數(shù)繪制細(xì)胞生長曲線；取第5代細(xì)胞，胰酶消化后，用流式細(xì)胞儀檢測干細(xì)胞相關(guān)表面抗原CD13、CD73、CD34、CD45和HLA-DR；取第5代細(xì)胞接種于6孔板中，實驗組分別用誘導(dǎo)培養(yǎng)基向成脂及成骨方向誘導(dǎo)，對照組用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，檢測其多向分化潛能；取第5代細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶及24孔板中，實驗組用含有ActivinA、HGF、FGF、EGF、OSM、DMSO等細(xì)胞因子的兩階段法肝臟樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，對照組用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長情況，于誘導(dǎo)至第13天時，采用RT-PCR法檢測肝細(xì)胞相關(guān)基因表達，，采用PAS染色法檢測肝臟樣細(xì)胞糖原合成情況，采用細(xì)胞免疫組化法檢測肝細(xì)胞相關(guān)抗原的表達。 結(jié)果用消化離心法分離獲取的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞大小均勻，呈梭形的成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞增殖良好；細(xì)胞生長曲線測定表明接種后第3天細(xì)胞進入指數(shù)增長期，第6天后生長進入平臺期，體外能長期培養(yǎng)存活，并保持不分化狀態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測表明細(xì)胞高表達CD13、CD73，低表達CD34、CD45及HLA-DR；并能被誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞；上述結(jié)果表明成功構(gòu)建了人原代脂肪干細(xì)胞系。人脂肪干細(xì)胞經(jīng)成肝誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)由梭形逐漸變?yōu)槎嘟切位蝾悎A形。誘導(dǎo)至第13天時，RT-PCR檢測結(jié)果提示，實驗組細(xì)胞高表達ALB、AFP、CY3P4肝細(xì)胞相關(guān)基因，而對照組細(xì)胞呈低表達及無表達狀態(tài)；實驗組細(xì)胞PAS染色呈紅色陽性表現(xiàn)；細(xì)胞免疫組化證實，實驗組細(xì)胞高表達肝細(xì)胞特異性抗體HepPar-1、AFP、CK18、CK19，與肝癌細(xì)胞表達相同，而對照組細(xì)胞則表現(xiàn)為陰性。 結(jié)論利用消化離心法在體外能分離得到脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外可長期存活，反復(fù)傳代，誘導(dǎo)后可分化為肝臟樣細(xì)胞，為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞做為細(xì)胞治療、生物人工肝及肝組織工程的種子細(xì)胞提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 分離 鑒定 誘導(dǎo) 肝臟樣細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R575.3
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-12
• 引言12
• 材料與方法12-21
• 結(jié)果21-28
• 討論28-32
• 總結(jié)32-33
• 參考文獻33-37
• 文獻綜述37-45
• 參考文獻40-45
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章45-46
• 致謝46-47

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本文編號：857259