發(fā)布時間：2017-08-16 14:30

  本文關鍵詞：S1PR3特異性激動劑上調巨噬細胞ROS水平促進細菌清除改善膿毒癥小鼠預后

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【摘要】：研究背景膿毒癥(Sepsis)是指感染引起的全身炎癥反應綜合癥,是臨床上一種常見且較難治療的綜合征。膿毒癥具有發(fā)病率高、死亡率高及醫(yī)療負擔重等特點,全球每年有超過1800萬嚴重膿毒癥病例,死亡率高達30-50%,是重癥監(jiān)護室(Intensive Care Unit,及ICU)患者的主要死因之一。膿毒癥的發(fā)病機制十分復雜,其中感染和炎癥反應在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用。在膿毒癥早期階段,感染引起促炎癥介質的大量釋放,并由此導致嚴重的組織器官損傷,其中肺臟是膿毒癥的首位受累靶器官。若病情得不到及時控制,機體由免疫功能亢進轉為免疫功能抑制,使得原發(fā)病原微生物和機會感染菌大量繁殖,最終導致患者死亡。巨噬細胞作為機體固有免疫系統(tǒng)中的重要效應細胞在免疫監(jiān)視及防御中發(fā)揮著關鍵作用。病原體可誘發(fā)巨噬細胞分泌多種生物活性物質,如NO、TNF-α、ROS等,其中ROS作為第二信使參與細胞信號傳導,是重要的免疫調節(jié)因子。細胞內適宜濃度的ROS可干擾細菌的DNA轉錄和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)合成,殺滅病菌或破壞細胞膜、干擾酶的功能,從而清除微生物。盡管以TLRs為首的模式識別受體及其介導的信號轉導通路在膿毒癥的發(fā)病機制中占據十分重要的地位,但近些年來的研究發(fā)現針對TLRs為靶向的膿毒癥治療并未取得理想效果。S1P受體(Sphingosine 1-phosphate receptor, S1PRs)是一類G蛋白偶聯受體,與磷酸分子1-磷酸硝胺醇(Sphingosine 1-phosphate, SIP)結合,啟動細胞跨膜信號轉導效應,介導S1P發(fā)揮其第一信使作用,調節(jié)細胞增殖,血管生成和炎癥反應。S1PR3作為S1PRs家族中一個主要成員,它與三種G蛋白發(fā)生偶聯(Gi、Gq、G12/G13),介導了廣泛的生物學效應。當前,對S1PR3調控中樞及外周固有免疫細胞促炎作用的研究較為廣泛,而其在病原微生物清除中的作用并不明確。研究目的本研究旨在通過第一部分：設計合成S1PR3特異性激動劑KRX-725,建立腹腔細菌感染膿毒癥模型,并特異性干預S1PR3功能,分析STPE3對膿毒癥小鼠生存率,細菌復合及肺臟損傷的影響。第二部分：體外觀察KRX-725對巨噬細胞產生活性氧(ROS)的調節(jié)作用,對巨噬細胞細菌清除功能的影響。探討S1PR3參與細菌清除的功能及其分子機制。研究方法采用大腸桿菌(E.coli)腹腔注射小鼠誘導膿毒癥模型。并采用S1PR3特異性激動劑KRX-725于建模后進行腹腔注射治療,對照組給予等體積的溶劑。兩組分別于治療后第8、16、24、32、40、48小時,觀察膿毒癥小鼠生存率情況。KRX-725治療組及對照組分別于膿毒癥模型后24h,取外周血及腹腔灌洗液,按比例進行梯度稀釋,LB平板培養(yǎng)過夜,計算出每毫升血液或腹腔灌洗液細菌集落數(colony forming units, CFU).并于建模后24小時取肺臟組織,固定、制作石蠟切片及HE染色,進行肺損傷評分。體外Fluid Thioglycollate Medium誘導小鼠腹腔巨噬細胞,按比例應用E.coli刺激小鼠巨噬細胞,時間分別為0 min,10min,20min,30min,40min,50min和60min,刺激結束后,檢測ROS水平。用同樣方法所得的腹腔巨噬細胞,進行慶大霉素保護實驗。實驗數據使用SPSS17.0軟件做統(tǒng)計學分析,生存率分析采用Log-rank Test,計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示,組間數據比較采用獨立樣本T檢驗分析,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。研究結果1. 小鼠腹腔注射大腸桿菌,成功誘導膿毒癥模型,KRX-725治療組膿毒癥小鼠(n=12)生存率顯著高于對照組(n=12),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2. 在KRX-725干預后24小時,KRX-725治療組(n=5)每毫升血液中的CFU值顯著低于對照組(P0.05),兩組的腹腔灌洗液CFU值差異更為顯著(P0.01)。3. 在KRX-725治療后24h進行觀察(n=3),對照組有典型的急性肺損傷的組織學改變,包括肺泡充血、大量炎性細胞滲出浸潤、彌漫性肺泡損傷等,而KRX-725治療組肺損傷的組織學變化明顯減輕,其急性肺損傷評分也顯著低于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。4. E.coli體外刺激巨噬細胞,檢測細胞內ROS的水平,KRX-725治療組活性氧(ROS)的水平在第20min時明顯高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),在第30min時差異最為顯著(P0.01)。5. 慶大霉素保護實驗結果,KRX-725治療組細胞內的細菌存活數明顯低于對照組(p0.05),6小時兩組之間的差異更為顯著(p0.01)。研究結論體內研究發(fā)現,S1PR3特異性激動劑KRX-725可顯著改善膿毒癥小鼠生存率,并降低膿毒癥小鼠24小時腹腔及血液細菌負荷,減輕肺臟損傷。體外研究發(fā)現,S1PR3特異性激動劑通過上調巨噬細胞中活性氧(ROS)的水平,增強細胞清除細菌的能力,改善膿毒癥預后。該研究結果不僅為S1PR3在膿毒癥的早期防治機制的作用提供新的見解,也為膿毒癥和其他感染性疾病提供新的潛在的治療靶點。
【關鍵詞】：膿度癥 細菌清除 KRX-725 ROS 巨噬細胞
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R459.7
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-16
• 參考文獻14-16
• 第一部分 S1PR3特異性激動劑對膿毒癥小鼠預后的影響16-29
• 1 材料與方法16-22
• 2 結果22-25
• 3 討論25-26
• 4 結論26-27
• 參考文獻27-29
• 第二部分 S1PR3特異性激動劑對巨噬細胞殺菌功能的影響及機制29-38
• 1 材料與方法29-33
• 2 結果33-35
• 3 討論35-36
• 4 結論36-37
• 參考文獻37-38
• 全文結論38-39
• 綜述39-61
• 參考文獻51-61
• 作者簡歷及攻讀學位期間發(fā)表的論文61

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