本文關鍵詞：血管內(nèi)皮細胞抗發(fā)形霞水母觸手提取物縮血管反應的作用及機制研究

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【摘要】：目的： 探討血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cells，VECs）在抗發(fā)形霞水母（Cyanea capillata）觸手提取物（tentacle extract，TE）縮血管反應中的保護作用，為防治C.capillata蜇傷提供新思路和新靶點。 方法： 1、驗證TE對人奇靜脈內(nèi)皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）的毒性作用： 1.1MTT法測細胞存活率：收集我國沿海C. capillata并經(jīng)鑒定后提取C.capillata TE樣品。①以濃度梯度為控制因素，加入不同濃度（0μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml、320μg/ml）TE孵育細胞密度為4×105個/ml的HUVEC細胞6h，MTT法檢測經(jīng)HUVEC細胞的存活率。②另一方面以不同濃度（1μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml）TE不同時間（6h，12h，24h，48h）孵育細胞密度為4×105個/ml的HUVEC細胞，MTT法檢測HUVEC細胞的存活率。 1.2流式細胞術測TE作用后HUVEC細胞凋亡壞死：加入不同濃度（0μg/ml、1μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml）TE處理HUVEC細胞6h后，采用流式細胞分析檢測HUVEC細胞的凋亡。 2、血管舒縮因子前列環(huán)素（Prostacyclin，PGI2）、血栓素（Thromboxane，TXA2）、血管緊張素（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ）含量檢測： 2.1加入不同濃度TE（0μg/ml，1μg/ml，，2.5μg/ml，5μg/ml）作用HUVEC細胞6h，采用ELISA檢測不同濃度TE作用HUVEC細胞后分泌PGI2、TXA2、AngⅡ的含量。 2.2濃度為5μg/ml TE加入HUVEC細胞后，分別作用0min、5min、30min、2h、6h、12h后，采用ELISA檢測TE不同孵育時間HUVEC細胞分泌PGI2、TXA2、AngⅡ的含量。 3、觀察SD大鼠股動脈血壓（Blood pressure，BP）變化： SD大鼠（280～320g）麻醉后，行股主動脈插管及頸靜脈插管法，分別予①對照組（0.9%生理鹽水組）；②1.4mg/ml TE組；③10μmol/L環(huán)氧合酶抑制劑（吲哚美辛）+1.4mg/ml TE組；④10μmol/L血管緊張素轉換酶抑制劑（卡托普利）+1.4mg/ml TE組藥物干預。觀察1h內(nèi)股動脈BP的變化情況，以明確藥物干預效果及VECs在TE縮血管毒性過程中的保護作用，并為臨床治療水母蜇傷篩選出有效的治療藥物。 4、SD大鼠心臟、腎臟功能的影響： 在整體動物檢測BP變化情況實驗結束后，迅速從股動脈插管處抽取實驗動物動脈血，檢測心肌酶、腎功能（LDH、CK、sCr及BUN）。結果： 1、TE對HUVEC細胞存活率的影響： ①當TE濃度小于2.5μg/ml時，HUVEC細胞存活率為100%，細胞活性與正常對照組（TE濃度0μg/ml）相比無明顯統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；當TE濃度大于5μg/ml時，HUVEC細胞開始出現(xiàn)死亡，TE濃度為5μg/ml時細胞存活率為97.55%，TE濃度為10μg/ml時細胞存活率為50%，當TE濃度為320μg/ml時HUVEC細胞已幾乎全部死亡，細胞存活率僅為4.83%，以上結果均有統(tǒng)計學意義。因此在濃度為5～320μg/ml范圍內(nèi)時TE對HUVEC細胞的毒性作用具有濃度依賴性，隨著TE濃度的增加其對HUVEC細胞毒性增強。 ②同一濃度TE隨著預孵時間的延長，對HUVEC細胞產(chǎn)生的毒性作用不斷增強，TE的毒性作用具有時間依賴性(P0.05)；當TE濃度為1μg/ml時，分別預孵HUVEC細胞6h和12h可見細胞存活率大于100%，由此可知TE在低濃度（≤1μg/ml）短時間（≤12h）內(nèi)對HUVEC細胞具有促生長的作用，當TE濃度為2.5μg/ml時，預孵6h時細胞存活率100%，TE濃度為5μg/ml時，預孵6h時細胞開始出現(xiàn)死亡，TE濃度10μg/ml時HUVEC細胞大量死亡，細胞存活率小于50%(P0.05)。 由以上實驗可知，濃度為5μg/ml的C.capillata TE預孵HUVEC細胞6h可引起細胞死亡,因此選擇濃度為5μg/ml的TE做后續(xù)的實驗；10μg/mlTE預孵6h可引起細胞明顯死亡。 2、TE致HUVEC細胞凋亡與壞死： TE濃度在1～10μg/ml濃度時，導致的細胞壞死不明顯（P＞0.05），在1μg/ml和2.5μg/ml濃度時TE導致的細胞凋亡尚不明顯（P＞0.05），當TE濃度5μg/ml時可有部分細胞凋亡，當TE濃度10μg/ml時可有大量細胞凋亡（P＜0.05）。 3、血管舒縮因子PGI2、TXA2、AngⅡ含量檢測： ①PGI2隨TE作用濃度增加分泌量逐漸增大，TXA2隨TE作用濃度增加分泌量無明顯變化，PGI2/TXA2隨TE作用濃度增大比值增大，AngⅡ隨TE濃度增大分泌量增大，以上結果均有統(tǒng)計學意義。故HUVEC細胞分泌的PGI2、AngⅡ及PGI2/TXA2比值在TE作用下可發(fā)生變化，且具有劑量依賴性，隨TE濃度增大而增大。 ②TE（5μg/ml）預孵HUVEC細胞一定時間內(nèi)（0min～12h）可引起HUVEC細胞舒縮因子PGI2、TXA2、AngⅡ分泌量改變，PGI2隨著TE刺激時間的延長分泌量逐漸增加，5min時分泌量達高峰，6h分泌量開始下降，但分泌量仍高于正常水平，12h與6h分泌量無明顯差別；TXA2隨著TE刺激時間的增加分泌量逐漸增高，在6h到達高峰，12h與6h分泌量無明顯差別； AngⅡ在5min分泌量仍高于正常水平，在2h達最高值，6h分泌量又下降，但分泌量仍高于正常水平，分泌量6h與12h分泌量無明顯差別，以上結果均具有統(tǒng)計學意義。 4、SD大鼠股動脈BP變化 在觀察時間（60min）內(nèi)，與對照組（0.9%生理鹽水組）相比，1.4mg/ml TE組SD大鼠股動脈BP在前10min內(nèi)明顯下降，10min時達最低值，后逐漸升高，60min時恢復至起始BP水平，整個觀察時間內(nèi)BP平均值均低于對照組；10μmol/L環(huán)氧合酶抑制劑（吲哚美辛）+1.4mg/ml TE組在觀察時間內(nèi)BP值較對照組無明顯變化；10μmol/L血管緊張素轉換酶抑制劑（卡托普利）+1.4mg/mlTE組在前10min內(nèi)BP先下降后升高，在20～30min內(nèi)恢復至對照組水平，后BP繼續(xù)升高，且高于對照組，以上結果均具有統(tǒng)計學意義。 5、SD大鼠心、腎功能檢測： 在整體動物股動脈BP監(jiān)測實驗結束后，從股動脈抽取實驗動物動脈血，低溫超速離心后取上清，行血生化檢測結果顯示與對照組（0.9%生理鹽水組）相比，1.4mg/ml TE組SD大鼠心肌酶譜（LDH、CK）明顯升高，腎功能（sCr、BUN）嚴重損害；10μmol/L環(huán)氧合酶抑制劑（吲哚美辛）+1.4mg/ml TE組、10μmol/L血管緊張素轉換酶抑制劑（卡托普利）+1.4mg/ml TE組心肌酶（LDH、CK）升高較1.4mg/ml TE組低，腎功能（sCr、BUN）損害較較1.4mg/ml TE組輕，以上結果均具有統(tǒng)計學意義。 結論： 1.證明了TE對HUVEC細胞有直接的毒性作用，一定濃度TE及預孵時間可導致HUVEC細胞壞死與凋亡，降低細胞存活率。 2.TE作用HUVEC細胞，HUVEC細胞分泌PGI2、TXA2、AngⅡ含量可發(fā)生變化，HUVEC細胞通過對舒縮因子分泌量的調節(jié)，以此來拮抗TE引起的血管收縮反應。 3. TE可降低動物平均動脈BP及造成嚴重心腎功能損害，環(huán)氧合酶抑制劑（吲哚美辛）、血管緊張素轉換酶抑制劑可調節(jié)VECs分泌舒縮因子PGI2、TXA2、AngⅡ的含量而拮抗TE特異的縮血管反應及降BP效應，并且減輕了心腎功能損傷。
【關鍵詞】：血管內(nèi)皮細胞 發(fā)形霞水母毒素 血管收縮 血管舒縮因子 吲哚美辛 卡托普利
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R646
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 英文縮寫及全文和中文對照表14-15
• 第1章 引言15-18
• 技術路線18-19
• 第2章 材料與儀器19-23
• 2.1 實驗動物19
• 2.2 實驗細胞19
• 2.3 實驗試劑19-20
• 2.3.1 主要購置試劑19-20
• 2.3.2 主要配置試劑20
• 2.4 實驗儀器20-21
• 2.5 動靜脈導管制備21-23
• 第3章 方法23-28
• 3.1 實驗思路23
• 3.2 C. capillata 采集與 TE 獲取23
• 3.3 HUVEC 細胞培養(yǎng)23-24
• 3.4 檢測 TE 對 HUVEC 的毒性作用24-25
• 3.4.1 MTT 檢測 HUVEC 細胞存活率24
• 3.4.2 流式細胞技術檢測 HUVEC 細胞凋亡24-25
• 3.5 ELISA 法檢測血管舒縮因子 PGI2、TXA2、AngⅡ分泌量25-26
• 3.6 SD 大鼠動脈 BP 監(jiān)測觀察 VEC 的生物學效應及拮抗藥物的干預效果26-27
• 3.7 心肌酶（LDH、CK）、腎功能（sCr、BUN）檢測27
• 3.8 統(tǒng)計學處理27-28
• 第4章 實驗結果28-39
• 4.1 MTT 法檢測細胞存活率28-30
• 4.1.1 不同濃度 TE 作用對 HUVEC 細胞存活率的影響28-29
• 4.1.2 不同濃度、不同時間 TE 作用對 HUVEC 細胞存活率的影響29-30
• 4.2 Annexin V-PI 雙染檢測細胞凋亡30-32
• 4.3 ELISA 法檢測血管舒縮因子 PGI2、TXA2、AngⅡ分泌量32-35
• 4.3.1 檢測不同濃度 TE 作用 HUVEC 細胞后 PGI2、TXA2、AngⅡ分泌量32-34
• 4.3.2 檢測同一濃度 TE 不同作用時間 HUVEC 細胞 PGI2、TXA2、AngⅡ分泌量34-35
• 4.4 SD 大鼠動脈 BP 監(jiān)測觀察 VEC 的體內(nèi)效應及拮抗藥物的干預效果35-37
• 4.5 SD 大鼠心、腎功能生化指標檢測37-39
• 第5章 討論39-44
• 5.1 血管內(nèi)皮細胞在發(fā)形霞水母毒素毒性反應中的屏障保護作用39-40
• 5.2 血管內(nèi)皮細胞在水母毒素反應中對血管舒縮因子分泌量的調節(jié)40-42
• 5.3 VECs 抗 TE 縮血管毒性反應的效應及初步藥物篩選42-44
• 第6章 結論與展望44-45
• 6.1 結論44
• 6.2 展望44-45
• 致謝45-46
• 參考文獻46-49
• 攻讀學位期間的研究成果49-50
• 綜述50-56
• 摘要50-55
• 參考文獻55-56

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 周穎;陳虹;;血管內(nèi)皮細胞功能紊亂與心血管疾病關系的研究進展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2006年08期

本文編號：648626