本文關鍵詞：ILK在SD大鼠皮膚燒傷創(chuàng)面愈合過程中的作用

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【摘要】：研究背景： 隨著社會人口老齡化趨勢增長，糖尿病潰瘍、放射性潰瘍、壓力性潰瘍等慢性創(chuàng)面發(fā)病率明顯增加。因此，創(chuàng)面愈合已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學研究重點之一。創(chuàng)面愈合是局部組織的再生，涉及到表皮結(jié)構再生和真皮組織重構的復雜生物學過程。目前，創(chuàng)面愈合確切機制尚未明確，組織修復的效果尚不能令人滿意。有關創(chuàng)面愈合分子機制已成為學者們關注的熱點。進一步深入研究創(chuàng)面愈合分子機制，有利于拓展創(chuàng)面治療的思路和手段，對提高創(chuàng)面愈合的速度和質(zhì)量具有積極意義。 整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）是一種組織器官廣泛表達的絲氨酸/蘇氨酸激酶。它介導PKB/AKT、Wnt、LEF-1和β-catenin等多種細胞信號通路調(diào)控，對細胞的遷移、增殖、分化和凋亡等生物學功能起重要作用，并介導細胞-細胞及細胞與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）之間的相互作用。國內(nèi)外最新研究發(fā)現(xiàn)ILK在維持皮膚真皮穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用，是損傷修復必不可少的細胞應答組成部分[1-2]。本課題前期研究在細胞水平發(fā)現(xiàn)ILK能夠通過AKT下游信號通路參與成纖維細胞（fibroblast，F(xiàn)b）的遷移、分化、增殖、凋亡，影響創(chuàng)面愈合，同時也發(fā)現(xiàn)ILK與大鼠燒傷創(chuàng)面愈合有高度相關性，但ILK對燒傷創(chuàng)面愈合的作用機制還需進一步探討。 本研究以大鼠皮膚深Ⅱ°燒傷創(chuàng)面為模型，利用ILK重組慢病毒技術轉(zhuǎn)染大鼠創(chuàng)面周圍，上調(diào)ILK表達；同時使用ILK特異性抑制劑QLT0267抑制ILK活性，觀察ILK在創(chuàng)面愈合過程中的作用以及與Fn、I型膠原、α-SMA和AKT磷酸化的關系，這將有助于完善創(chuàng)面愈合的分子生物學理論，為創(chuàng)面分子水平和基因治療提供新思路。 第一部分燒傷創(chuàng)面動物模型的制備 目的制備穩(wěn)定準確的大鼠燒傷創(chuàng)面模型。 方法20只SD大鼠隨機分為4組，采用恒溫恒壓燙傷儀分別致傷4、6、8、10s，致傷過程以底面積2.5cm2、質(zhì)量0.5kg的80℃圓柱形燙頭垂直接觸大鼠脊柱左右兩側(cè)對稱皮膚，24h后采集各組大鼠的創(chuàng)面組織行病理組織學檢查，根據(jù)病理結(jié)果篩選出深Ⅱ°創(chuàng)面的致傷時間，制備大鼠皮膚燒傷創(chuàng)面模型。 結(jié)果根據(jù)病理切片檢查證實8s燙傷的實驗創(chuàng)面為深Ⅱ°燒傷創(chuàng)面。 結(jié)論應用YLS-5Q型燙傷儀底面積2.5cm2、質(zhì)量0.5kg、燙頭溫度80℃、作用時間8s致傷大鼠背部皮膚，可制備深Ⅱ°燒傷模型。第二部分燒傷創(chuàng)面內(nèi)ILK基因轉(zhuǎn)染及對創(chuàng)面愈合率的影響 目的探討燒傷創(chuàng)面內(nèi)ILK基因轉(zhuǎn)染及對創(chuàng)面愈合率的影響。 方法采用ILK重組慢病毒載體，將三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細胞包裝慢病毒，用Western Blot法檢測目的基因ILK質(zhì)粒表達。正式試驗采用SD大鼠75只，在其背部皮膚制備深Ⅱ°創(chuàng)面，并隨機分成5組，每組15只，分別是：①對照組：每天注射生理鹽水100μL；②LV-GFP組：一次性注射空質(zhì)粒慢病毒100μL （2E+8TU/mL）；③LV-GFP-ILK組：一次性注射ILK過表達慢病毒液100μL（2E+8TU/mL）；④QLT0267組：每天注射濃度100μMQLT0267液100μL；⑤DMSO組：每天注射含0.3%DMSO液100μL。實驗持續(xù)21d，各組大鼠單獨飼養(yǎng)，自由采食和飲水。測量各組大鼠創(chuàng)面愈合時間和愈合率。LV-GFP-ILK組用慢病毒液注射大鼠創(chuàng)面周圍皮下，于注射后第14d取材，每組5只大鼠，標本行冰凍切片，倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況；于注射后第7d、10d、14d、21d取材，Western Blot法檢測轉(zhuǎn)染后ILK蛋白表達，所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析處理。 結(jié)果LV-GFP-ILK組大鼠創(chuàng)面皮膚樣品的冰凍切片在熒光顯微鏡可見GFP表達，且ILK蛋白表達水平高LV-GFP組。第14d時，LV-GFP-ILK組創(chuàng)面愈合率為96.89%，QLT0267組創(chuàng)面愈合率56.32%，在各個時相均顯著低于其他3組（P0.05），對照組、LV-GFP組和DMSO組三組之間創(chuàng)面愈合率無統(tǒng)計學意義（P0.05）。 結(jié)論皮下注射ILK重組慢病毒能成功感染大鼠創(chuàng)面周圍的正常組織，并能顯著上調(diào)ILK蛋白水平，且這一效應相對持久、穩(wěn)定。上調(diào)ILK表達創(chuàng)面愈合率增高，抑制ILK活性則創(chuàng)面愈合率降低，，說明ILK具有促進創(chuàng)面愈合作用。 第三部分ILK在創(chuàng)面愈合過程中的作用以及與Fn、I型膠原、α-SMA和AKT磷酸化的關系 目的通過上調(diào)ILK表達或抑制ILK活性，檢測Fn、I型膠原、α-SMA等影響創(chuàng)面愈合過程的重要蛋白表達，探討ILK在創(chuàng)面愈合過程的作用及其可能機制。 方法動物試驗分組及處理同第二部分。在試驗第14d，各組隨機選擇5只大鼠，應用免疫組化SP法和Western Blot法分別檢測ILK、AKT、PAKT在各組大鼠創(chuàng)面中的表達；對創(chuàng)面肉芽組織進行組織學染色，觀察創(chuàng)面及周圍組織結(jié)構的改變；PCR檢測大鼠皮膚組織Fn、I型膠原、 ILK、α-SMA的基因表達。 結(jié)果SP法和Western Blot法檢測：5組AKT蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P0.05），LV-GFP-ILK組ILK蛋白表達增高（P0.05）， PAKT蛋白表達也明顯增高（P0.05），創(chuàng)面新生表皮更厚、膠原沉積率更多； QLT0267組PAKT蛋白表達較其他組明顯降低（P0.05）。PCR檢測顯示ILK mRNA表達增強后Fn mRNA、I型膠原mRNA、α-SMAmRNA表達增強。 結(jié)論燒傷創(chuàng)面組織中ILK水平提高能顯著上調(diào)Fn、I型膠原、α-SMA基因的表達；ILK活性與PAKT蛋白表達量呈正相關。因此，ILK可能通過PI3K-AKT-PAKT途徑，促進創(chuàng)面的愈合。
【關鍵詞】：整合素連接激酶 創(chuàng)面愈合 慢病毒載體 QLT0267
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R644
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• ABSTRACT6-10
• 目錄10-11
• 前言11-14
• 第一部分 燒傷創(chuàng)面動物模型的制備14-19
• 材料與方法14-16
• 結(jié)果16-17
• 討論17
• 結(jié)論17-19
• 第二部分 燒傷創(chuàng)面內(nèi) ILK 基因轉(zhuǎn)染及對創(chuàng)面愈合率的影響19-31
• 材料與方法19-23
• 結(jié)果23-24
• 討論24-25
• 結(jié)論25-31
• 第三部分 ILK 在創(chuàng)面愈合過程中的作用以及與 Fn、I 型膠原、α-SMA和 AKT 磷酸化的關系31-53
• 材料與方法31-37
• 結(jié)果37-39
• 討論39-41
• 結(jié)論41-53
• 參考文獻53-59
• 中英文縮略詞對照表59-60
• 攻讀期間取得成果60-61
• 致謝61

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本文編號：627477