本文關(guān)鍵詞：磷酸化HSP27保護燒傷血清刺激條件下血管內(nèi)皮屏障的作用與機制研究

  更多相關(guān)文章： 燒傷 F-actin HSP27 SUMO化修飾 磷酸酶2A 內(nèi)皮通透性

【摘要】：血管通透性增高是燒傷早期休克和臟器水腫的根本原因,其本質(zhì)是血管內(nèi)皮屏障通透性的增高,從而導(dǎo)致早期血管內(nèi)液大量外滲,引發(fā)全身組織灌注減少和組織器官水腫。由于燒傷早期血管通透性增高機制尚未得到充分證實,目前臨床上缺少有效的防治措施。因此,深入揭示燒傷后微血管通透性變化的分子調(diào)節(jié)機制,研究防治微血管滲漏和燒傷休克的新型策略,具有重要的理論價值和臨床意義。內(nèi)皮細(xì)胞回縮是多種病理生理(包括燒傷)條件下內(nèi)皮細(xì)胞間裂隙形成、微血管通透性增高的重要基礎(chǔ)。以往認(rèn)為,應(yīng)力纖維中F-actin與肌球蛋白相互作用,產(chǎn)生向心收縮力,是內(nèi)皮細(xì)胞回縮的骨架基礎(chǔ),而HSP27磷酸化則是應(yīng)力纖維形成的重要分子機制。然而,最近有研究發(fā)現(xiàn),磷酸化HSP27通過促進應(yīng)力纖維形成或保護F-actin骨架,顯著降低了缺氧或急性炎癥等條件下血管內(nèi)皮通透性。p38激酶/MK2是HSP27磷酸化的關(guān)鍵信號途徑。我們以往發(fā)現(xiàn),燒傷后血管內(nèi)皮通透性增高并不與應(yīng)力纖維形成相平行。燒傷后內(nèi)皮細(xì)胞F-actin骨架發(fā)生了復(fù)雜變化,即:早期形成應(yīng)力纖維,后期F-actin破壞、解聚或排列紊亂。我們前期預(yù)實驗結(jié)果顯示,燒傷血清刺激條件下內(nèi)皮細(xì)胞HSP27磷酸化水平僅短暫升高。鑒于磷酸化HSP27降低血管通透性作用的相關(guān)認(rèn)識,我們推測,p38激酶-HSP27磷酸化很可能是燒傷后血管內(nèi)皮屏障的重要保護性適應(yīng)機制,只是隨著時間延長,促通透性因素的級聯(lián)放大,p38激酶-HSP27磷酸化這一保護性適應(yīng)機制不斷削弱,使得血管通透性增高。本項目提出HSP27磷酸化是燒傷后血管內(nèi)皮屏障的重要保護性適應(yīng)機制的假設(shè)。擬以燒傷患者血清為刺激因素,以大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞為對象,采用基因突變技術(shù)構(gòu)建磷酸化和非磷酸化HSP27表達突變體,探討HSP27的磷酸化狀態(tài)與燒傷血清刺激條件下肺血管內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)力纖維形成和通透性變化的關(guān)系;從蛋白磷酸酶PP2A調(diào)節(jié)HSP27去磷酸化和SUMO化修飾對MK2活性的抑制作用兩方面,初步明確HSP27磷酸化隨時間削弱的分子機制。研究對深入揭示燒傷后微血管通透性變化的分子調(diào)節(jié)機制,從細(xì)胞內(nèi)源性保護角度促成防治微血管滲漏和燒傷休克的新型策略,具有重要意義。一、研究目的探討磷酸化hsp27在燒傷血清刺激誘導(dǎo)血管內(nèi)皮通透性變化中的作用及其調(diào)節(jié)機制。二、研究內(nèi)容1.hsp27磷酸化、蛋白表達和分布與內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)力纖維形成、通透性變化關(guān)系的研究2.hsp27磷酸化在燒傷血清刺激誘導(dǎo)血管內(nèi)皮通透性變化中的作用3.pp2a與mk2的sumo化修飾對hsp27磷酸化的調(diào)節(jié)作用研究三、研究方法1.按常規(guī)方法收集嚴(yán)重?zé)齻颊哐?淺二度、深二度和三度燒傷面積50%的患者)2.培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞,利用transwell小室建立單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性實驗?zāi)Ｐ?采用跨單層內(nèi)皮細(xì)胞電阻法(teer)評估內(nèi)皮單層通透性變化。3.采用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色技術(shù)觀察內(nèi)皮細(xì)胞zo-1、f-actin形態(tài)分布變化;采用imagej軟件計算內(nèi)皮細(xì)胞間隙和細(xì)胞表面積變化。4.采用westernblot技術(shù)檢測燒傷血清刺激條件下內(nèi)皮細(xì)胞p38激酶、mk2和hsp27磷酸化水平以及mk2的sumo化修飾。5.構(gòu)建磷酸化、非磷酸化和野生型hsp27腺病毒高表達載體,并成功轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞。6.采用oa抑制pp2a和轉(zhuǎn)染senp1腺病毒抑制mk2的sumo化修飾,探討pp2a去磷酸化作用和sumo化修飾抑制mk2活性對hsp27磷酸化的調(diào)節(jié)作用。四、主要結(jié)果1.燒傷血清刺激1h,肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性顯著增強,隨著刺激時間延長,通透性進一步增強;同時,細(xì)胞間緊密連接完整性破壞,伴細(xì)胞間裂隙增加和細(xì)胞表面積縮小。2.燒傷血清刺激0.5h,內(nèi)皮細(xì)胞中央型f-actin應(yīng)力纖維形成增多;隨著刺激時間延長,中央型f-actin應(yīng)力纖維消失,代之以不規(guī)則的細(xì)胞周邊型f-actin形成增多。3.燒傷血清使p38mapk-mk2-hsp27信號通路激活;其中,p38mapk/mk2呈持續(xù)活化,而hsp27磷酸化僅在燒傷血清刺激0.5h時大幅增強,隨后迅速回落。hsp27磷酸化瞬時增強與內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)力纖維形成時間相吻合,二者高峰均出現(xiàn)于內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高之前。4.構(gòu)建的磷酸化、非磷酸化和野生型HSP27腺病毒高表達載體能有效轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞并高表達目的蛋白。較之非磷酸化HSP27和空載體轉(zhuǎn)染對照組,磷酸化HSP27轉(zhuǎn)染能顯著抑制燒傷血清導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性,使細(xì)胞中央型F-actin應(yīng)力纖維形成增多。此外,磷酸化HSP27可以部分對抗細(xì)胞松弛素D導(dǎo)致的內(nèi)皮通透性增高。5.內(nèi)皮細(xì)胞PP2A可與HSP27發(fā)生相互作用,且這一作用在燒傷血清刺激條件下進一步增強,抑制PP2A可使燒傷血清刺激條件下內(nèi)皮細(xì)胞HSP27磷酸化部分增強。內(nèi)皮細(xì)胞中MK2存在SUMO化修飾,且該修飾作用在燒傷血清刺激條件下進一步增強。高表達SENP1可顯著解除SUMO蛋白對MK2活性的抑制作用,使HSP27的磷酸化水平升高。6.HSP27磷酸化是維護燒傷血清刺激條件下內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的適應(yīng)性保護反應(yīng),其通過促進中央型F-actin應(yīng)力纖維形成對抗血管內(nèi)皮高通透性。PP2A對HSP27的去磷酸化作用和SUMO化修飾對MK2活性的抑制作用是燒傷血清刺激條件下HSP27磷酸化迅速削弱的重要分子機制。
【關(guān)鍵詞】：燒傷 F-actin HSP27 SUMO化修飾 磷酸酶2A 內(nèi)皮通透性
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R644
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 HSP27 磷酸化、蛋白表達和分布與內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)力纖維形成、通透性變化關(guān)系的研究15-29
• 2.1 材料與方法15-23
• 2.2 結(jié)果23-26
• 2.3 討論26-27
• 2.4 小結(jié)27-29
• 第三章 磷酸化HSP27在燒傷血清誘導(dǎo)血管內(nèi)皮高通透性中的作用與機制29-39
• 3.1 材料與方法29-32
• 3.2 結(jié)果32-37
• 3.3 討論37-38
• 3.4 小結(jié)38-39
• 第四章 燒傷后內(nèi)皮細(xì)胞HSP27磷酸化隨時間削弱的分子調(diào)節(jié)機制39-48
• 4.1 材料與方法39-42
• 4.2 結(jié)果42-46
• 4.3 討論46-47
• 4.4 小結(jié)47-48
• 全文結(jié)論48-49
• 參考文獻49-52
• 文獻綜述 血管內(nèi)皮通透性的體外檢測方法52-58
• 參考文獻56-58
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果58-59
• 致謝59

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