發(fā)布時間：2017-06-28 21:08

  本文關鍵詞：微小RNA在糖尿病創(chuàng)面中的差異表達及GM-CSF的干預作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:觀察糖尿病大鼠與正常大鼠皮膚創(chuàng)面組織微小RNA(miRNA)差異表達以及重組人粒細胞巨噬細胞刺激因子(rhGM-CSF)凝膠對糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合及微小RNA表達的影響,為進一步探討糖尿病創(chuàng)面難愈合機制及其靶向治療提供理論依據(jù)和實驗基礎。方法:(1)雄性清潔級SD大鼠,體重200~250g,一次性腹腔注射鏈脲佐菌素65mg/kg建立糖尿病大鼠模型。4周后取糖尿病成模大鼠及正常大鼠各6只于背部制備全層皮膚切除創(chuàng)面,造模3 d后手術切取上述創(chuàng)面組織。用Trizol抽提總RNA并質檢,純化后進行熒光標記、芯片雜交,然后掃描得到雜交圖片。利用軟件提取數(shù)據(jù)并行差異分析。實時定量RT-PCR驗證芯片結果。(2)另取大鼠18只同前述方法建立糖尿病模型,4周后取其中穩(wěn)定成模的16只糖尿病大鼠于背部兩側制作4個面積為(4.32±0.14)cm2全層皮膚缺損創(chuàng)面。采用配對設計、盲法、隨機數(shù)字表法分為2組,揭盲顯示A組為rhGM-CSF凝膠組、B組為外用型凝膠基質組。2組均每日涂布藥膏1次,厚度為3 mm(rhGM-CSF實際作用量約為1μg/cm2),至傷后14 d。大體觀察各組創(chuàng)面愈合情況,并于傷后3、7 d計算創(chuàng)面愈合率。傷后3、7、14 d,分別取1、2、4只糖尿病大鼠采集標本,行HE染色觀察組織病理學改變,免疫組織化學染色檢測創(chuàng)面CD31和PCNA表達。傷后7 d另取3只糖尿病大鼠采集組織樣本,同前法行芯片檢測并驗證其結果。對差異表達明顯的微小RNA行京都基因和基因組百科全書(KEGG)信號通路功能富集分析。對數(shù)據(jù)行配對樣本t檢驗或兩樣本t檢驗。結果:(1)篩選出在糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面組織中上調的微小RNA有18個,下調65個。其中顯著上調的微小RNA有大鼠-微小RNA-496-5p、大鼠-微小RNA-105、大鼠-微小RNA-122-5p等;顯著下調的微小RNA有大鼠-微小RNA-196a-5p、大鼠-微小RNA-134-5p、大鼠-微小RNA-31-3p等。PCR的驗證結果與與芯片檢測結果接近。功能富集分析顯示差異表達明顯的miR-31、miR-222、miR-449a等微小RNA分別參與有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)、Wnt、Notch等與創(chuàng)面修復相關的信號通路。(2)①傷后3 d兩組創(chuàng)面肉芽組織增生明顯,傷后7 d兩組創(chuàng)腔均基本被肉芽組織填平(其中A組創(chuàng)面縮小更明顯且肉芽組織量多),傷后14 d A組全部創(chuàng)面基本愈合而B組部分創(chuàng)面仍存在少許創(chuàng)腔及結痂。傷后3、7 d,A組創(chuàng)面愈合率分別為(41±5)%和(75±4)%均明顯高于B組的(31±9)%和(71±4)%(P值均小于0.001)。②傷后3 d兩組創(chuàng)面表皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞(Fb)等組織修復細胞均排列稀疏,有大量炎性細胞浸潤(其中B組創(chuàng)面組織修復細胞及炎性細胞均較少)。傷后7 d兩組創(chuàng)面內皮細胞、Fb排列漸致密,浸潤的炎性細胞較前減少(其中A組創(chuàng)面組織修復細胞數(shù)量較B組多)。傷后14 d兩組創(chuàng)面組織中內皮細胞、Fb細胞排列明顯致密(其中A組表皮完全覆蓋創(chuàng)面,B組部分創(chuàng)面仍有炎性浸潤)。③傷后3、7 d兩組創(chuàng)面肉芽組織中CD31和PCNA陽性表達均明顯,傷后14 d表達均減弱。傷后3、7、14 d,A組創(chuàng)面CD31和PCNA陽性表達均較B組明顯(P0.05)。④總RNA抽提及質檢判定樣本總量、純度、完整性均符合實驗要求。微小RNA芯片檢測篩選,與B組比較A組創(chuàng)面組織中的微小RNA上調18個、下調13個。⑤實時定量RT-PCR的驗證結果顯示A組創(chuàng)面組織中大鼠-微小RNA-29b、大鼠-微小RNA-347的表達量較B組分別為上調2.58倍、下調1.89倍;與芯片檢測結果接近(分別為上調2.67倍、下調2.18倍)。⑥KEGG信號通路功能富集分析顯示差異表達明顯的微小RNA參與MAPK信號途徑、Wnt信號途徑、轉化生長因子β信號途徑、表皮生長因子受體信號途徑等與創(chuàng)面修復相關的信號通路。結論:(1)糖尿病大鼠與正常大鼠皮膚創(chuàng)面組織中的微小RNA表達差異明顯,功能富集分析顯示其與創(chuàng)面修復相關的信號通路密切相關,可能與糖尿病創(chuàng)面難愈合機制存在密切的聯(lián)系。(2)rhGM-CSF凝膠可促進糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合,引起創(chuàng)面組織中微小RNA差異性表達,這可能是其促進創(chuàng)面愈合在基因轉錄后水平上的靶點。
【關鍵詞】：粒細胞巨噬細胞集落刺激因子 重組 糖尿病 實驗性 傷口愈合 基因表達譜 微小RNA
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1;R641
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第一部分 糖尿病創(chuàng)面與正常創(chuàng)面微小RNA差異表達譜分析11-26
• 1 前言11
• 2 材料和方法11-17
• 2.1 材料11-12
• 2.1.1 實驗動物11-12
• 2.1.2 主要試劑12
• 2.1.3 主要儀器12
• 2.2 方法12-17
• 2.2.1 糖尿病大鼠模型的建立12-13
• 2.2.2 糖尿病大鼠與正常大鼠創(chuàng)面模型的建立13
• 2.2.3 樣本采集13
• 2.2.4 提取組織中的總RNA13-14
• 2.2.5 總RNA質量檢查14
• 2.2.6 總RNA的分離純化14
• 2.2.7 微小RNA的熒光標記和芯片雜交14-15
• 2.2.8 雜交芯片的清洗、掃描和芯片數(shù)據(jù)提取15
• 2.2.9 芯片數(shù)據(jù)處理15
• 2.2.10 實時熒光定量RT-PCR驗證芯片結果15-17
• 2.2.11 差異表達微小RNA功能富集分析17
• 3 結果17-24
• 3.1 糖尿病大鼠成模情況17
• 3.2 總RNA質檢結果17-18
• 3.3 微小RNA芯片檢測結果18-20
• 3.4 實時定量RT-PCR檢測結果20-21
• 3.5 差異表達微小RNA功能富集分析結果21-24
• 4 討論24-26
• 第二部分 重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子對糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合及微小RNA表達的影響26-37
• 1 前言26
• 2 材料與方法26-30
• 2.1 材料26-28
• 2.1.1 實驗動物26-27
• 2.1.2 主要試劑27
• 2.1.3 主要儀器27-28
• 2.2 方法28-30
• 2.2.1 糖尿病大鼠模型的建立28
• 2.2.2 糖尿病大鼠創(chuàng)面模型的建立28
• 2.2.3 觀測指標及評價方法28-29
• 2.2.4 微小RNA差異表達檢測及驗證29-30
• 2.2.5 統(tǒng)計學處理30
• 3 結果30-35
• 3.1 糖尿病大鼠成模情況30
• 3.2 創(chuàng)面愈合情況30-31
• 3.3 組織病理學觀察31
• 3.4 創(chuàng)面CD31和PCNA抗體表達31-32
• 3.5 微小RNA差異表達檢測結果及驗證32-35
• 3.5.1 總RNA抽提及質檢32
• 3.5.2 微小RNA芯片檢測結果32-34
• 3.5.3 實時熒光定量RT-PCR檢測34
• 3.5.4 KEGG信號通路功能富集分析34-35
• 4 討論35-37
• 全文結論37-38
• 致謝38-39
• 參考文獻39-42
• 附圖42-50
• 攻讀學位期間的研究成果50-51
• 綜述51-63
• 參考文獻58-63

【參考文獻】

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本文編號：495259