膿毒癥(Sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合,可導(dǎo)致多器官功能障礙甚至死亡。膿毒癥是當(dāng)前重癥監(jiān)護(hù)病房(Intensive Care Unit,ICU)面臨的棘手難題,是除冠心病外ICU病人死亡的首要原因。一方面因?yàn)槟摱景Y由不同的微生物引起,導(dǎo)致相應(yīng)的疫苗難以開發(fā);另一方面,由于抗生素的濫用,耐藥菌株不斷產(chǎn)生,應(yīng)用抗生素控制感染越發(fā)困難。因此,盡管對于膿毒癥的發(fā)病機(jī)制的研究取得了很大的進(jìn)展,目前對于膿毒癥的治療,仍然沒有特效的藥物。所以,人們迫切需要發(fā)展新型的治療膿毒癥的方法。第一部分DUSP1啟動子熒光素酶報(bào)告基因RAW264.7細(xì)胞體系的建立以及測試絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶 1(Mitogen-activated protein kinase phosphatase 1,MKP-1)是一種可誘導(dǎo)的細(xì)胞核磷酸酶,能使絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)去磷酸化,因此,它是MAPK活動的負(fù)性調(diào)控因子。研究發(fā)現(xiàn)MKP-1在固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中都是一個(gè)關(guān)鍵的內(nèi)源性負(fù)性調(diào)控因子,用敲除MKP-1的小鼠研究發(fā)現(xiàn)MKP-...

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【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一部分 DUSP1啟動子熒光素酶報(bào)告基因RAW264.7細(xì)胞體系的建立以及測試
    前言
    1.1 材料和方法
        1.1.1 主要試劑
        1.1.2 主要儀器
        1.1.3 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)
        1.1.4 pGL4.19/PrDUSP1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        1.1.5 挑陽性克隆,搖菌,提質(zhì)粒(用去內(nèi)毒素中提試劑盒)
        1.1.6 G418最佳濃度的篩選
        1.1.7 電轉(zhuǎn)染、細(xì)胞篩選和單克隆化
        1.1.8 熒光素酶活性檢測
        1.1.9 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄
        1.1.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-PCR)
        1.1.11 統(tǒng)計(jì)分析
    1.2 結(jié)果
        1.2.1 pGL4.19質(zhì)粒載體圖譜
        1.2.2 RAW264.7/PrDUSP1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的篩選
        1.2.3 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞熒光素酶活性呈時(shí)間依賴性
        1.2.4 Rolipram可增加熒光素酶活性的表達(dá)
        1.2.5 Rolipram能上調(diào)RAW264.7細(xì)胞MKP-1 mRNA的表達(dá)
    1.3 討論
    參考文獻(xiàn)
第二部分 Rolipram對膿毒癥小鼠治療作用的研究
    前言
    2.1 材料和方法
        2.1.1 主要試劑
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)動物
        2.1.4 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.1.5 細(xì)胞培養(yǎng)上清的收集
        2.1.6 LPS引起的膿毒癥小鼠生存率實(shí)驗(yàn)
        2.1.7 小鼠血清、肺、肝和腎樣品收集
        2.1.8 細(xì)胞因子檢測
        2.1.9 石蠟切片和HE染色
        2.1.10 血清生化指標(biāo)檢測
        2.1.11 支氣管肺泡灌洗、灌洗液總細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和總蛋白測定
        2.1.12 細(xì)胞總蛋白和組織總蛋白的提取與BCA蛋白定量
        2.1.13 Western-blot
        2.1.14 肺組織免疫熒光
        2.1.15 致病性大腸桿菌引起的膿毒小鼠生存率實(shí)驗(yàn)
        2.1.16 CLP模型小鼠生存率實(shí)驗(yàn)
        2.1.17 統(tǒng)計(jì)分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 Rolipram能抑制LPS引起的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清中促炎細(xì)胞因子的釋放
        2.2.2 Rolipram能大幅提高LPS引起的膿毒癥小鼠的生存率
        2.2.3 Rolipram能降低LPS引起的膿毒癥小鼠血清中促炎細(xì)胞因子的生成
        2.2.4 Rolipram能減輕LPS引起膿毒癥小鼠的肺損傷
        2.2.5 Rolipram能減輕LPS引起的肝和腎功能損傷
        2.2.6 Rolipram能抑制小鼠肺中LPS引起的NF-κB信號通路的激活
        2.2.7 Rolipram能抑制小鼠肺中LPS引起的MAPK信號通路的激活
        2.2.8 Rolipram能大幅提高大腸桿菌引起的膿毒癥小鼠的生存率和CLP模型小鼠的生存率
    2.3 討論
    參考文獻(xiàn)
英文縮寫詞表
攻讀博士學(xué)位期間成果
致謝



本文編號：3740933