研究目的:創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)不是單一的病理、生理過(guò)程,主要包括原發(fā)性和繼發(fā)性損傷過(guò)程,共同導(dǎo)致了神經(jīng)結(jié)構(gòu)的破壞和功能的受損。繼發(fā)性神經(jīng)炎癥反應(yīng)是TBI后重要的繼發(fā)性病理生理反應(yīng),在繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮了重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)最重要的固有免疫細(xì)胞和主要的效應(yīng)細(xì)胞,在TBI后繼發(fā)性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。更好的理解小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)機(jī)制可以提高我們對(duì)TBI后神經(jīng)損傷及修復(fù)的認(rèn)識(shí),并為T(mén)BI的新治療策略的開(kāi)發(fā)提供機(jī)會(huì)。但小膠質(zhì)細(xì)胞激活、分化的分子調(diào)控機(jī)制極為復(fù)雜,具體機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞微粒(Microparticles,MPs)是一類介于0.1到1?μm大小的小細(xì)胞囊泡,它們含有多種生物活性分子,包括蛋白質(zhì)、生物脂類和核酸,穿梭于細(xì)胞間發(fā)揮遞質(zhì)作用,是導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生相關(guān)炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。由于腦組織細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)較體內(nèi)其它細(xì)胞更高,因此腦組織來(lái)源的MPs(Brain-derived Microparticles,BDMPs)的促炎活性可能比血細(xì)胞源性的MPs要更高。然而B(niǎo)DMPs的分子生物學(xué)特點(diǎn)尚不十分清楚,未見(jiàn)其在TBI后的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)中作用的相關(guān)研究報(bào)道。因此,本課題借助小鼠腦皮層下注射模型及體外小膠質(zhì)細(xì)胞,觀察BDMPs對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響及相關(guān)炎性反應(yīng),探索BDMPs通過(guò)介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞在TBI后繼發(fā)性炎癥反應(yīng)中的作用及其機(jī)制。研究方法(1)建立小鼠液壓打擊腦外傷(TBI)模型,使用酶消化梯度離心法從TBI后腦損傷區(qū)提取BDMPs,應(yīng)用應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)TBI后腦損傷區(qū)BDMPs進(jìn)行表型鑒定以及成分分析;(2)借助小鼠大腦皮層下注射模型,免疫熒光染色觀察小鼠腦注射區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況,采用免疫組化染色觀察其激活,增殖以及分化(M1/M2)情況,應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-l0及單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)的RNA含量;(3)將BDMPs與小膠質(zhì)細(xì)胞(BV2)中共培養(yǎng),應(yīng)用離子電導(dǎo)顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和形變情況,應(yīng)用western-blot和ELISA技術(shù)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-l0及單核細(xì)胞趨化因子(MCP-1/CCL-2)的含量變化。(4)借助小鼠大腦皮層下注射模型,通過(guò)伊文思藍(lán)注射觀察血腦屏障破壞情況,干濕重法對(duì)比腦水腫程度。體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)模擬腦血管屏障,加入BDMPs干預(yù),觀察HUVEC屏障的通透性變化。研究結(jié)果(1)BDMPs表達(dá)數(shù)量不等的生物標(biāo)記物(NSE和GFAP),進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)BDMPs是由多細(xì)胞源性MPs構(gòu)成,以神經(jīng)元性及膠質(zhì)細(xì)胞源性MPs為主,還含有血細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源MPs;(2)小鼠腦皮層下注射區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞被BDMPs廣泛激活,形態(tài)由分支樣向球形轉(zhuǎn)化,并出現(xiàn)M1/M2表型的動(dòng)態(tài)分化。PCR結(jié)果顯示腦組織中炎癥因子IL-1β,TNF-a,IL-6,單核細(xì)胞趨化因子CCL2和NOS2的mRNA增多;(3)體外實(shí)驗(yàn)中小膠質(zhì)細(xì)胞與BDMPs共培養(yǎng)52分鐘后開(kāi)始發(fā)生形變,104分鐘后完全激活形變。3小時(shí)后,小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)合并吞噬BDMPs,細(xì)胞裂解液中IL-6,TNF-α和MCP-1水平顯著升高,上清液ELISA實(shí)驗(yàn)提示TNF-α和MCP-1水平增高,但I(xiàn)L-10水平均無(wú)顯著變化;(4)BDMPs注射后小鼠腦組織表面可見(jiàn)明顯水腫,依文思藍(lán)滲漏現(xiàn)象也比較嚴(yán)重。體外加入BDMPs懸液時(shí),HUVEC屏障對(duì)FITC-Dextran的滲漏顯著增加;研究結(jié)論(1)BDMPs可以結(jié)合并介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、形變以及分化,促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-6等多種炎性因子以及單核細(xì)胞趨化因子MCP-1/CCL-2高表達(dá),在TBI后的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮促炎作用。(2)BDMPs可以增加BBB的通透性,加重腦水腫。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R651.15
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文13圖1.1 流式細(xì)胞儀鑒定BDMPs A: 根據(jù)Megamix標(biāo)準(zhǔn)微粒確定MPs的位置；B:圈選直徑＜0.9 μm的P1區(qū)域，即為MPs；C：以APC-Annexin V+EDTA和NSE/GFAP的IgG為對(duì)照，圈選Q2-5二者雙陽(yáng)性區(qū)域，即為BDMP（sAnnexin V+ NSE/GFAP）。1.2.2 BDMPs中的各種細(xì)胞MPs含量分析選取P2區(qū)域的BDMPs進(jìn)一步鑒別各種細(xì)胞來(lái)源MPs的含量，進(jìn)入上述各種熒光標(biāo)記的峰狀圖（與各自-IgG為同型對(duì)照）：神經(jīng)細(xì)胞來(lái)源MPs：（FITC-NSE）陽(yáng)性率為43.2±11.4％（圖1.2A）膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源MPs：（FITC-GFAP）陽(yáng)性率為36

熒光標(biāo)記的峰狀圖（與各自-IgG為同型對(duì)照）：神經(jīng)細(xì)胞來(lái)源MPs：（FITC-NSE）陽(yáng)性率為43.2±11.4％（圖1.2A）膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源MPs：（FITC-GFAP）陽(yáng)性率為36.8±10.3％（圖1.2B）血小板來(lái)源MPs：（FITC-CD42b）陽(yáng)性率為3.1±0.9％（圖1.2C）白細(xì)胞來(lái)源MPs：（PE-Cy7-CD45）陽(yáng)性率為2.3±0.9％（圖1.2D）內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源MPs：（Fluor 450-CD144）陽(yáng)性率為1.5±0.3％（圖1.2E）紅細(xì)胞來(lái)源MPs：（APC-CD235）陽(yáng)性率為3.8±0.8％（圖1.2F）

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文比較采用SNK法。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 18.0，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2 結(jié)果.1 小鼠皮層下注射模型的建立將提前制備好的 BDMPs 與上清液 1:1 稀釋制成 BDMPs 懸液，大約06BDMPs/10ul，通過(guò)立體定向裝置，利用 10ul 微量注射器，將 10ulBD注入到小鼠的皮層下接近基底節(jié)位置，前期對(duì) BDMPs 懸液的濃度和注行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) 10ul，1:1 稀釋濃度的 BDMPs 懸液既能在小鼠皮層明顯的損傷區(qū)域，并且建模過(guò)程中小鼠也有較高的生存率。為了排除小膠質(zhì)細(xì)胞和炎性反應(yīng)的影響，設(shè)置 10ul 上清液皮層下注射對(duì)照組以組。相對(duì)于研究 TBI 模型中 BDMPs 的作用機(jī)制，單獨(dú)皮層下注射 BD有助于規(guī)避 TBI 后腦損傷區(qū)復(fù)雜的干擾因素的影響。如圖 2.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 毛景洋;;深圳先進(jìn)院首破腦內(nèi)再殖小膠質(zhì)細(xì)胞起源之謎[J];高科技與產(chǎn)業(yè)化;2018年09期

2 范沖竹;;暗小膠質(zhì)細(xì)胞:一種主要與病理狀態(tài)相關(guān)的新表型[J];中國(guó)病理生理雜志;2016年07期

3 梁菲;;運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控阿爾茨海默病的分子機(jī)制[J];當(dāng)代體育科技;2014年29期

4 張思磊;王雄偉;;小膠質(zhì)細(xì)胞/腦巨噬細(xì)胞與膠質(zhì)瘤研究進(jìn)展[J];海南醫(yī)學(xué);2015年20期

5 姜文敏;唐羅生;賀達(dá)仁;;小膠質(zhì)細(xì)胞在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病機(jī)制中的作用[J];醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(臨床決策論壇版);2011年10期

6 馬怡然;郭大文;孫偉;方文剛;;小膠質(zhì)細(xì)胞的活化對(duì)其Aβ吞噬能力的影響[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2010年01期

7 黃秀艷;曾耀英;張彩;朱斌;;人小膠質(zhì)細(xì)胞的分離、純化、特異分子表達(dá)與吞噬功能研究[J];中國(guó)病理生理雜志;2008年05期

8 熊懷林,范光碧,胡興宇;小膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血中的作用[J];四川解剖學(xué)雜志;2005年02期

9 劉鋒,朱長(zhǎng)庚;小膠質(zhì)細(xì)胞激活的分子機(jī)制[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2003年02期

10 楊逢春;顯示小膠質(zhì)細(xì)胞方法的改進(jìn)[J];解剖學(xué)研究;2002年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 唐亞梅;李子晨;許鵬飛;徐永騰;彭英;;放射后小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能及相關(guān)信號(hào)機(jī)制研究[A];7th中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)全國(guó)中青年神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)暨第十屆全國(guó)神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病與腦脊液細(xì)胞學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2014年

2 韓書(shū)珍;李雪梅;牛文澤;陳翔;王果;李澤宜;;激光掃描共聚焦顯微鏡觀察大鼠局灶性腦缺血半暗區(qū)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的變化及意義[A];第六屆江浙滬兒科學(xué)術(shù)會(huì)議暨兒科學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展學(xué)術(shù)班論文匯編[C];2009年

3 陸浩慧;羅婷婷;武勝昔;鄺芳;;1型小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)小鼠焦慮樣行為、學(xué)習(xí)、記憶的影響[A];第十九屆全國(guó)心理學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議摘要集[C];2016年

4 巨富榮;張勝祥;;小膠質(zhì)細(xì)胞在小鼠全腦缺血模型中的形態(tài)變化[A];第三屆中國(guó)西部動(dòng)物學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2014年

5 李捷;劉勇;張蓬勃;肖新莉;呂海俠;李敏杰;康前雁;鄧美英;;大鼠局灶性腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源[A];解剖學(xué)雜志——中國(guó)解剖學(xué)會(huì)2002年年會(huì)文摘匯編[C];2002年

6 楊陽(yáng);廖萬(wàn)清;郭秀軍;林敏;王志東;徐紅;陳孫孝;溫海;;新生隱球菌對(duì)鼠小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)組的影響[A];第二屆全國(guó)深部真菌感染學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

7 姚瑤;Stefania Echeverry;Xiang Qun Shi;Qiu Zi Yang;傅開(kāi)元;Yves De Koninck;Ji Zhang;;脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞去除后的動(dòng)態(tài)變化[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)疼痛學(xué)分會(huì)第十二屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2016年

8 趙銘;李冬;朱迅;閆東梅;;小膠質(zhì)細(xì)胞的激活在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中作用的研究進(jìn)展[A];第十二屆全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)摘要匯編[C];2017年

9 趙敏;袁云;趙培園;李t

本文編號(hào)：2819401