【摘要】：目的:創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic Brain Injury,TBI)是由直接外力引起的腦組織結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙,具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)。TBI是青壯年死亡和殘疾的最主要的原因,全世界每年約近五千萬人會(huì)遭受腦挫傷。TBI所致腦損傷包括外力直接作用引起的原發(fā)性損傷以及隨后發(fā)生的繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷包括腦挫傷、腦血管損傷、軸索損傷等。繼發(fā)性損傷是直接損傷造成的一系列細(xì)胞及生化級(jí)聯(lián)反應(yīng),是導(dǎo)致腦損傷死亡或功能障礙的重要原因,包括氧化應(yīng)激、谷氨酸興奮性毒性、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等。氧化應(yīng)激和炎癥是繼發(fā)性損傷的重要機(jī)制,理論上提高抗氧化反應(yīng)和降低炎癥反應(yīng)可以減輕TBI引起的繼發(fā)性腦損傷。核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor-erythroid derived 2-related factors,Nrf2),屬于CNC-bZIP(cap‘n’collar subfamily of basic leucine zipper),即CNC亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族,是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)因子。生理狀態(tài)下,Nrf2與其胞漿蛋白伴侶分子Keap1(Kelch-like ECH associated protein1)結(jié)合形成穩(wěn)定的二聚體,并錨定于細(xì)胞質(zhì)的肌動(dòng)蛋白上,導(dǎo)致Nrf2迅速泛素化和蛋白酶體依賴性的降解。當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下,受到親電子化合物或氧化物作用時(shí),Nrf2和Keap1解偶聯(lián),由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),與小Maf蛋白或其他bZIP蛋白結(jié)合成異二聚體,識(shí)別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant response element,ARE)或親電子元件(Electrophile Response Elements,EpRE)上的相應(yīng)序列,從而啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明,Nrf2在腦損傷和神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要的神經(jīng)保護(hù)作用。小鼠TBI后,Nrf2被激活,誘導(dǎo)細(xì)胞抗氧化反應(yīng)。當(dāng)小鼠缺乏Nrf2時(shí),TBI引起更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激性損傷和功能障礙,Nrf2激動(dòng)劑(包括蘿卜硫素、叔丁基苯二酚等)則可以明顯改善TBI引起的繼發(fā)性損傷。我們推測(cè),Nrf2可能是臨床上治療腦挫傷的重要靶點(diǎn)。姜黃素(curcumin)是從姜黃Curcuma longa L中分離出來一種化合物。姜黃素具有抗炎和抗氧化等生物學(xué)活性。迄今為止,研究者已經(jīng)完成了100多項(xiàng)針對(duì)姜黃素的臨床試驗(yàn),這充分展現(xiàn)了姜黃素的安全性、耐受性及用于疾病治療的有效性。研究表明,在TBI和缺血再灌注損傷中,姜黃素可以通過血腦屏障進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,包括:改善腦水腫、炎癥、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、突觸可塑性等,但其分子機(jī)制目前尚不清楚。細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,姜黃素可以激活Nrf2通路,但姜黃素是否通過激活Nrf2通路實(shí)現(xiàn)TBI后的神經(jīng)保護(hù)作用,目前尚不清楚。在本實(shí)驗(yàn)中,內(nèi)源性Nrf2通路在小鼠TBI后被激活,我們首先研究了Nrf2在TBI后損傷周邊區(qū)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化,為法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中推斷腦損傷時(shí)間尋找生物學(xué)標(biāo)志物。接下來,我們應(yīng)用WT和Nrf2-KO小鼠給予姜黃素或溶劑,研究姜黃素是否通過激活Nrf2通路實(shí)現(xiàn)TBI后的神經(jīng)保護(hù)作用,為臨床上以Nrf2為靶點(diǎn)開展神經(jīng)保護(hù)性治療提供依據(jù)。研究方法:取8 12周成年雄性野生(WT)小鼠和Nrf2敲除(Nrf2-KO)小鼠(20 26g),應(yīng)用改良的Fenney的自由落體法制作中度腦挫傷模型。第一部分:將WT小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)和腦挫傷組(TBI),并于TBI后1d、3d、7d和14d腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死實(shí)驗(yàn)小鼠并取腦組織。應(yīng)用Western blot檢測(cè)TBI后不同時(shí)間段Nrf2的蛋白表達(dá),同時(shí)應(yīng)用免疫熒光染色檢測(cè)Nrf2在神經(jīng)元(NeuN)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)、小膠質(zhì)細(xì)胞(IBA1)和NG2膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化。第二部分:將WT和Nrf2-KO小鼠分別隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)和腦挫傷組(TBI),TBI組又隨機(jī)分為溶劑處理組(TBI+Veh)和姜黃素處理組(TBI+Cur)。TBI后24h腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死實(shí)驗(yàn)小鼠并取腦組織。應(yīng)用Western blot和qRT-PCR檢測(cè)Nrf2及其下游基因(Hmox-1,Nqo1,Gclm,and Gclc)的蛋白和mRNA表達(dá);檢測(cè)氧化應(yīng)激性損傷(測(cè)定MDA水平)、腦水腫(測(cè)定brain water content)、神經(jīng)細(xì)胞變性(FJC、Tuj1免疫熒光染色)、細(xì)胞凋亡(Western blot檢測(cè)cleaved caspase-3、Bcl-2;TUNEL染色)及炎癥反應(yīng)(qRT-PCR檢測(cè)TNF-α,IL-6和IL-1β;MPO、IBA1免疫熒光染色)等相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果:第一部分:Nrf2的蛋白表達(dá)水平在TBI后1d達(dá)到高峰,以后逐漸下降。TBI后Nrf2在神經(jīng)元內(nèi)呈一過性高表達(dá),在傷后1d達(dá)到高峰,之后急劇減少。Nrf2在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)呈持續(xù)性低表達(dá),Nrf2陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量在傷后7d達(dá)到高峰。TBI后Nrf2在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯增高,Nrf2陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量在傷后7d達(dá)到高峰。我們也檢測(cè)了Nrf2在NG2膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),Nrf2在NG2膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)比率在傷后3d達(dá)到高峰。第二部分:在野生小鼠中,與溶劑處理組相比,姜黃素處理后,Nrf2及其下游基因表達(dá)水平明顯升高,而且Nrf2入核增加;氧化應(yīng)激性損傷減輕,腦水腫改善,變性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少,存活神經(jīng)元數(shù)量增加,細(xì)胞凋亡明顯改善,炎癥反應(yīng)降低。在Nrf2-KO小鼠中,Nrf2及其下游基因表達(dá)水平明顯降低;氧化應(yīng)激性損傷、腦水腫加重,變性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增加,存活神經(jīng)元數(shù)量明顯降低,細(xì)胞凋亡明顯加重,炎癥反應(yīng)增強(qiáng)。Nrf2-KO小鼠給予姜黃素處理后,未出現(xiàn)在WT小鼠實(shí)驗(yàn)中的明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)論:1、小鼠腦挫傷后,Nrf2在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增高。2、小鼠腦挫傷后,Nrf2在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)存在時(shí)間規(guī)律性。3、小鼠腦挫傷后,內(nèi)源性Nrf2通路被激活,姜黃素處理后,Nrf2通路被進(jìn)一步激活。4、姜黃素通過激活Nrf2通路實(shí)現(xiàn)TBI后的神經(jīng)保護(hù)作用。5、姜黃素通過激活Nrf2通路實(shí)現(xiàn)TBI后的抗炎、抗凋亡和抗氧化作用。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R651.15
【圖文】：

8圖 1 小鼠 TBI 后傷側(cè)皮質(zhì)損傷周邊區(qū)的形態(tài)學(xué)變化（A）小鼠中度腦挫傷模式圖，紅色區(qū)域?yàn)榇靷麉^(qū)，藍(lán)色與紅色之間區(qū)域?yàn)閾p傷周邊區(qū)；（B）小鼠中度腦挫傷后 24h，腦組織 HE 染色代表性圖片；（C）不同時(shí)間損傷周邊區(qū) HE 染色代表性圖片。Scale bar, 50 μm。3.2 小鼠 TBI 后傷側(cè)皮質(zhì)損傷周邊區(qū) Nrf2 蛋白表達(dá)應(yīng)用WB檢測(cè)了小鼠不同損傷時(shí)間后傷側(cè)皮質(zhì)損傷周邊區(qū)Nrf2的蛋白表達(dá)水平。傷后 1d，Nrf2 蛋白表達(dá)水平明顯增高，隨后其表達(dá)水平逐漸下降（圖 2）。

圖 2 小鼠腦挫傷后不同時(shí)間 Nrf2 的 Western blot 檢測(cè)結(jié)果小鼠腦挫傷后不同時(shí)間損傷周邊區(qū) Nrf2 的蛋白表達(dá)水平。* p < 0.05 vs. 正常對(duì)照組 vs. 相鄰上一組 (n = 6).3 小鼠 TBI 后傷側(cè)皮質(zhì)損傷周邊區(qū)神經(jīng)元內(nèi) Nrf2 的表達(dá)免疫熒光染色結(jié)果顯示，在正常腦皮質(zhì)神經(jīng)元（NeuN+）內(nèi)，免疫熒光顯的 Nrf2 陽(yáng)性熒光信號(hào)（表達(dá)）。腦挫傷后，NeuN 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量在傷明顯減少，之后趨于穩(wěn)定（圖3B）。傷后1d可見大量Nrf2陽(yáng)性神經(jīng)元（NeuN+ 3C），其中，Nrf2 陽(yáng)性神經(jīng)元占到神經(jīng)元數(shù)量的 80.2%（圖 3D，表 1）。 引起的神經(jīng)元內(nèi) Nrf2 高表達(dá)屬于一過性表達(dá)，在傷后 3d，表達(dá) Nrf2 的明顯減少（圖 3C），Nrf2 陽(yáng)性神經(jīng)元比率也顯著下降（圖 3D）。雖然在可見神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi) Nrf2 表達(dá)，但腦挫傷后神經(jīng)元內(nèi) Nrf2 表達(dá)主要集中

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊紹杰;孟金萍;屈yN;劉云波;;細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究進(jìn)展[J];中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志;2007年05期

本文編號(hào)：2722807