【摘要】：研究目的:創(chuàng)傷性顱腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)以其高致死致殘率成為世界范圍內(nèi)重要公共衛(wèi)生問題。創(chuàng)傷后原發(fā)性血腦屏障破壞導(dǎo)致腦血流灌注不足、血腦屏障通透性升高,代謝失衡、出凝血障礙等病理過程,引起繼發(fā)性腦損傷,加重血腦屏障開放,形成惡性循環(huán)。及時修復(fù)血腦屏障成為TBI治療的關(guān)注重點之一。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)又被稱作血管通透性因子,在血腦屏障開放、血管新生中起到重要作用。血管內(nèi)皮生長抑制因子(Vascular endothelial growth inhibitor,VEGI)是機體內(nèi)天然抑制VEGF的因子,且在抑制VEGF的同時并不影響血管內(nèi)皮細胞的正常功能。因此,本實驗在建立TBI動物模型的基礎(chǔ)上,檢測TBI后不同時間點VEGF和VEGI的表達變化,探討二者與血腦屏障通透性的相關(guān)聯(lián)系。通過側(cè)腦室注射VEGI純化蛋白對TBI急性期小鼠進行干預(yù)治療,觀察TBI后VEGF表達變化,血腦屏障通透性的改變,創(chuàng)傷側(cè)細胞凋亡水平和小鼠神經(jīng)運動功能。同時,探究VEGI對VEGF的下游作用機制,及其在TBI急性期抑制血管新生的作用機制。研究方法:1)在C57BL/6雄性小鼠上建立TBI模型,應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測TBI后不同時間點創(chuàng)傷側(cè)纖維蛋白原的含量。2)應(yīng)用Western Blot技術(shù)分別檢測TBI后不同時間點VEGF和VEGI的各自表達量。3)應(yīng)用立體定位側(cè)腦室微量注射技術(shù),對TBI后小鼠進行VEGI干預(yù)。4)通過改良的神經(jīng)功能缺損評分(modified Neurological Severity Score,mNSS)和錯步實驗對實驗各組進行神經(jīng)功能評分。篩選出差異最大時間點,進行后續(xù)探究。5)應(yīng)用Western Blot和免疫熒光技術(shù)檢測比較TBI第3天對照組和干預(yù)組血腦屏障通透性的變化。6)應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測VEGFR2和下游eNOS的磷酸化表達。7)應(yīng)用流式細胞技術(shù)和AnnexinV/PI試劑盒檢測比較創(chuàng)傷對照組和VEGI干預(yù)組小鼠創(chuàng)傷側(cè)細胞凋亡情況。8)應(yīng)用Western Blot、免疫熒光技術(shù)觀察血管新生相關(guān)細胞的變化。9)體外實驗中比較VEGI對內(nèi)皮細胞和周細胞成管能力的影響。10)應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測血管新生相關(guān)因子的相對表達變化。結(jié)果:1.TBI后小鼠血腦屏障開放在第3天最為顯著。VEGF在TBI后逐漸升高,第3天達峰值。VEGI在TBI后第3天下降明顯。綜合比較VEGF與VEGI比值發(fā)現(xiàn),VEGF/VEGI值在TBI后逐漸升高,在第3天最為明顯。2.VEGI干預(yù)后對TBI小鼠神經(jīng)運動功能改善從第3天開始出現(xiàn)明顯差異。VEGI干預(yù)明顯減少創(chuàng)傷側(cè)的細胞凋亡數(shù)量,減輕了血腦屏障開放程度。VEGI干預(yù)可以顯著抑制TBI急性期創(chuàng)傷側(cè)VEGFR2和其下游eNOS的磷酸化。3.VEGI干預(yù)顯著抑制了TBI后的血管新生,體現(xiàn)在對血管新生相關(guān)細胞的抑制和對血管新生相關(guān)因子之間平衡的調(diào)節(jié)。結(jié)論:1.TBI急性期后VEGF的單一變化不能完全解釋血腦屏障通透性升高的時間峰值,綜合VEGF與VEGI相對變化可能會更有效的研究TBI后血腦屏障損傷的原因。TBI急性期第3天VEGF相對于VEGI的高表達可能為血腦屏障通透性峰值的原因之一,為后續(xù)TBI急性期的治療奠定基礎(chǔ)。2.VEGI局部干預(yù)在TBI急性期對神經(jīng)功能的改善作用集中于TBI后第3天,我們選用創(chuàng)傷后第3天為后續(xù)實驗的重要觀察點。3.VEGI通過減少緊密連接蛋白的損傷,降低基質(zhì)金屬蛋白酶的表達,抑制VEGF-VEGFR-2下游的磷酸化,有效地降低了血腦屏障通透性。VEGI局部干預(yù)在TBI后第3天有效抑制創(chuàng)傷側(cè)的細胞凋亡。4.VEGI干預(yù)一定程度上恢復(fù)了TBI后促血管新生相關(guān)因子和抑制血管新生因子表達的失衡,減少了未成熟的新生血管的形成,以阻止血腦屏障通透性進一步的升高,從而緩解TBI后的繼發(fā)性損傷。
【圖文】：

正常腦組織的纖維蛋白原含量很低（如圖1.1 中的 sham 假手術(shù)組），僅為血管中的少許殘留，而由于創(chuàng)傷導(dǎo)致血管的直接損傷或組織缺氧造成的繼發(fā)性血腦屏障通透性升高，使原本在血管中的纖維蛋白原會滲出至腦組織中[6]。在損傷程度一定的情況下，局部組織中的纖維蛋白原表達量越高，提示血管通透性越高，可能引起的繼發(fā)性血管源性水腫越嚴重。本實驗應(yīng)用 Western Blot 技術(shù)分別觀察 TBI 后第 1、3、7 天創(chuàng)傷半球纖維蛋白原表達，結(jié)果顯示（圖 1.1）創(chuàng)傷后纖維蛋白原表達逐漸升高，于第 3 天達峰值(p***<0.001)，后下降，第 7 天時接近假手術(shù)組水平，并于第 3 天的含量由顯著性差異（p#<0.05）。提示，TBI 急性期以第 3 天為血腦屏障開放峰值

1.2.2 TBI 急性期中不同時間點 VEGF 與 VEGI 的相對表達檢測。本實驗分別觀察 TBI 后第 1、3、7 天 TBI 半球 VEGF 和 VEGI 的蛋白表達含量。圖 1.2 結(jié)果顯示，相較假手術(shù)組中 VEGF 的蛋白含量，TBI 后 VEGF 表達逐漸升高，于第 3 天時達峰值（p***<0.01）并持續(xù)至第 7 天（p**<0.01）；而 VEGI的蛋白在假手術(shù)組中（相較 VEGF）具有較高的表達，TBI 后第一天有下降趨勢，但并未達到統(tǒng)計學差異。于 TBI 后第 3 天達谷值（p*<0.05），后呈現(xiàn)逐漸恢復(fù)趨勢，即在 TBI 后第 7 天時蛋白含量與假手術(shù)組相比無統(tǒng)計學差異。我們由此將二者綜合計算不同時間點的 VEGF 與 VEGI 相對比值（VEGF/VEGI 比）， 并對此進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示 VEGF/VEGI 比在 TBI 后第 3 天顯著升高（p***<0.001），在TBI 后第 7 天有所下降，仍然高于假手術(shù)組(p*<0.05), 但是與第 3 天比較有顯著降低（p##<0.01）。提示：TBI 后急性期 VEGF 與 VEGI 的相對變化可能比單一因素的變化更為顯著，并可能與 TBI 急性期并發(fā)癥相關(guān)。 同時，由于 TBI 后第3 天的多種因素變化最為明顯，所以該時間點被選作為后續(xù)進一步研究觀察時間點。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R651.15

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本文編號：2688815