【摘要】：目的:對(duì)比研究人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)在普通二維培養(yǎng)與水凝膠三維培養(yǎng)條件下創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)因子的表達(dá)變化,為進(jìn)一步以水凝膠為載體的hAMSCs局部移植促進(jìn)創(chuàng)面愈合的臨床轉(zhuǎn)化研究提供前期的資料。方法:采用機(jī)械法聯(lián)合酶消化法分離提取hAMSCs并在普通二維條件下培養(yǎng),取第三代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)(FCM)技術(shù),三系(成脂、成骨、成軟骨)誘導(dǎo)分化,波形蛋白(vimentin)免疫熒光染色對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將上述生長(zhǎng)良好的第三代hAMSCs用無(wú)血清培養(yǎng)基制作細(xì)胞懸液后與ShakeGel ~TMM 3D水凝膠混合(體積比1:1)進(jìn)行三維培養(yǎng),培養(yǎng)7天后與普通二維培養(yǎng)條件下的hAMSCs進(jìn)行如下指標(biāo)檢測(cè)并進(jìn)行對(duì)比:(1)倒置相差顯微鏡觀察兩種培養(yǎng)條件下細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況;(2)波形蛋白免疫熒光染色;(3)激光共聚焦顯微鏡觀察Live/Dead染色鑒定細(xì)胞活力;(4)水凝膠中三維培養(yǎng)的hAMSCs采用激光共聚焦顯微鏡觀察誘導(dǎo)分化后的脂肪生成的主要調(diào)節(jié)因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPAR-γ)、成骨細(xì)胞分泌的骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)、成軟骨細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SOX9標(biāo)記物及鬼筆環(huán)肽的免疫熒光染色以檢測(cè)其誘導(dǎo)分化情況;(5)收集兩種培養(yǎng)條件下的hAMSCs,提取RNA并應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)測(cè)定其創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)因子mRNA相對(duì)表達(dá)量;(6)收集兩種培養(yǎng)條件下的細(xì)胞培養(yǎng)上清液,應(yīng)用ELISA技術(shù)測(cè)定創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)因子蛋白表達(dá)量。結(jié)果:(1)二維培養(yǎng)的第三代hAMSCs鏡下呈長(zhǎng)梭形旋渦狀生長(zhǎng)的典型間充質(zhì)樣細(xì)胞形態(tài),呈扁平紡錘狀緊貼細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶壁生長(zhǎng);流式細(xì)胞術(shù)鑒定hAMSCs高表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105,不表達(dá)或低表達(dá)CD34、CD19、CD45、CD11b、HLA-DR;波形蛋白陽(yáng)性表達(dá);分別進(jìn)行三系誘導(dǎo)分化后,茜素紅染色顯示成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞存在礦化結(jié)節(jié),油紅O染色顯示成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)脂滴聚集,甲苯胺藍(lán)染色顯示成軟骨誘導(dǎo)后細(xì)胞基質(zhì)中分泌大量的糖胺聚糖。(2)在水凝膠中三維培養(yǎng)的hAMSCs鏡下可見(jiàn)細(xì)胞均勻、多層分散于水凝膠中,呈立體圓形透亮狀,在×400鏡下可見(jiàn)細(xì)胞向四周稍伸出偽足;波形蛋白熒光染色呈陽(yáng)性,在細(xì)胞中呈立體圓形均勻分布;Live/Dead染色見(jiàn)水凝膠中細(xì)胞活性好,提示水凝膠對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性;三系誘導(dǎo)分化后成脂(PPAR?)、成骨(OCN)、成軟骨(SOX9)特異性分化標(biāo)記物的免疫熒光染色均為陽(yáng)性結(jié)果,提示其仍然具有誘導(dǎo)分化潛能,但鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn),細(xì)胞的形態(tài)未發(fā)生明顯改變,提示其分化潛能可能有所下降。(3)在水凝膠中三維培養(yǎng)后的hAMSCs較二維培養(yǎng)的hAMSCs創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)因子IL-6、IL-8、HGF、EGF、bFGF、VEGF、HA、Vimintin的mRNA相對(duì)表達(dá)量增加,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),IL-4、IL-10、TIMP、MMP、TGF-β1、KGF的表達(dá)較二維培養(yǎng)的hAMSCs的mRNA表達(dá)升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(4)在水凝膠中三維培養(yǎng)的hAMSCs的上清液較二維培養(yǎng)的hAMSCs的上清液中IL-6、IL-8、IL-10、HGF、EGF、bFGF、KGF、VEGF的蛋白表達(dá)量增加,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),IL-4、TIMP、MMP、TGF-β1的蛋白含量較二維培養(yǎng)的hAMSCs上清液表達(dá)升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:水凝膠作為hAMSCs的三維培養(yǎng)支架及細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境,生物相容性很好,可能使細(xì)胞的形態(tài)以及創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)因子的旁分泌生物學(xué)效應(yīng)能夠被更好的呈現(xiàn),是良好的hAMSCs載體,為進(jìn)一步進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化研究提供了部分前期研究資料。
【圖文】：

二維培養(yǎng)的hAMSCsP2代第3天（放大倍率×40）

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 楊曉雙CD44（96.23%）、CD73（99.54%）、CD90（96.88%）、CD105（98.58%）；CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR均呈陰性表達(dá)，，符合國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物的規(guī)定。2.2 二維培養(yǎng)的 hAMSCs 波形蛋白免疫熒光染色二維培養(yǎng)的 hAMSCs 經(jīng)免疫熒光染色后可見(jiàn)波形蛋白表達(dá)，說(shuō)明培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)來(lái)源細(xì)胞，綠色熒光呈扁平紡錘狀緊貼細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶壁（圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R641

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