【摘要】：目的:膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合,是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一。其發(fā)病率以每年8.7%的速度逐年增高,但死亡率卻沒有下降。嚴(yán)重膿毒癥和膿毒性休克死亡人數(shù)高于急性心肌梗死的死亡人數(shù)。膿毒癥的發(fā)病機(jī)制為早期過度的炎癥反應(yīng)及晚期淋巴細(xì)胞的過度凋亡。膿毒癥時淋巴細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制為激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(activation induced cell death,AICD)。糖皮質(zhì)激素早在20世紀(jì)40年代就被用于嚴(yán)重性全身感染的治療,但由于其除了抗炎作用外,尚有免疫抑制作用,至今對其能否提高膿毒性休克患者的生存率、改善預(yù)后尚存在爭議。糖皮質(zhì)激素治療膿毒癥引發(fā)爭議的原因在于糖皮質(zhì)激素作用的多樣性,尤其對于淋巴細(xì)胞的活性有雙向調(diào)節(jié)作用:一方面糖皮質(zhì)激素通過內(nèi)源性線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)未成熟的胸腺細(xì)胞、成熟的脾T淋巴細(xì)胞、前B淋巴瘤細(xì)胞及白血病細(xì)胞凋亡;另一方面可以通過糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid Receptor,GR),以DNA結(jié)合的方式下調(diào)Fas L基因的表達(dá),從而抑制AICD。由于糖皮質(zhì)激素對淋巴細(xì)胞的雙重作用,使其無法成為膿毒癥治療的理想藥物。與GR密切相關(guān)的鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptors,MR)也在T細(xì)胞上高度表達(dá),而在其他具有吞噬作用的白細(xì)胞上表達(dá)很低,這提示MR可能調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能,而不影響免疫系統(tǒng)的清除細(xì)菌的功能。目前臨床應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療膿毒性休克的作用機(jī)制普遍認(rèn)為是通過GR介導(dǎo)的。由于GR的過于廣泛的基因調(diào)節(jié)作用,使糖皮質(zhì)激素治療有相當(dāng)多的副作用。MR激動劑與GR激動劑相似,通過糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(glucocorticoid response element,GRE)和負(fù)性糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(negative glucocorticoid response element,n GRE)啟動子結(jié)合位點(diǎn)來發(fā)揮其作用,但目前發(fā)現(xiàn)的MR作用的靶基因較少。MR對淋巴細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的作用尚無報道。本研究中擬檢測兩種腎上腺皮質(zhì)激素受體對于激活誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的人外周血T細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。選擇地塞米松(dexamethasone,DEX),一種選擇性的GR受體激動劑,和去氧皮質(zhì)酮(deoxycorticosterone,DOC),一種選擇性的MR受體激動劑作為干預(yù)藥物。(1)探索GR和MR受體激動劑對于有絲分裂原-植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)或者金黃色葡萄球菌超抗原(Staphylococcus aureus enterotoxin B,SEB)誘導(dǎo)的人原代培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞凋亡的作用;(2)探索DEX和DOC對于外源性凋亡途徑的激活(caspase-8)和相關(guān)的信號分子IL-2和Fas L的作用;(3)探索GR和MR在基因的誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄抑制和直接DNA結(jié)合方面的作用;(4)最后超表達(dá)野生型和突變型MR(轉(zhuǎn)錄抑制功能逆轉(zhuǎn)為轉(zhuǎn)錄激活功能)來驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄抑制是一種可能的機(jī)制,以及DOC的作用的MR依賴性。旨在為鹽皮質(zhì)激素治療膿毒癥提供理論依據(jù),為提高膿毒癥的治療提供有益的線索。方法:從健康志愿者外周血分離淋巴細(xì)胞,體外培養(yǎng)2周后用PHA或SEB誘導(dǎo)其凋亡。采用流式記錄法檢測細(xì)胞凋亡及熒光檢測法測試細(xì)胞caspase-8,caspase-9/6,caspase-3活性,進(jìn)一步檢測DEX和DOC作用下細(xì)胞凋亡及上述caspases活性的變化。在PHA與12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)刺激的Jurkat細(xì)胞檢測IL-2及IL-2 m RNA和Fas L m RNA水平及DEX與DOC作用下IL-2及IL-2 m RNA和Fas L m RNA水平。為檢測DEX和DOC的作用是否為轉(zhuǎn)錄水平,引入蛋白合成抑制劑環(huán)己酰亞胺(cytoheximide,CHX),檢測CHX存在下,DEX和DOC對IL-2 m RNA和Fas m RNA的作用。將Fas L報告基因質(zhì)粒、NF-κB報告基因質(zhì)粒、及NF-κB位點(diǎn)突變的Fas L報告基因質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入Jurkat細(xì)胞,檢測熒光素酶活性及DEX和DOC作用后對其活性的影響。為進(jìn)一步探索GR和MR對Fas L基因的作用及其作用機(jī)制,采用凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測DEX和DOC對于含有NF-κB/AP-1序列的IL-2啟動子探針及含有NF-κB/GRE序列的Fas L啟動子探針與核蛋白復(fù)合體的結(jié)合作用的影響。最后為檢測DOC的作用的MR依賴性,將NF-κB或Fas L報告基因質(zhì)粒及野生型MR質(zhì)�；蝻@性負(fù)突變的MR基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞,檢測Fas L的表達(dá)及DEX及DOC對Fas L轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的影響。結(jié)果:PHA或SEB均可以誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的人外周血T細(xì)胞凋亡及caspase-8、caspase-9/6、caspase-3活性升高。DEX或DOC均可減低細(xì)胞凋亡百分率及caspase-8、caspase-9/6、caspase-3活性。PHA可以誘導(dǎo)人外周血T細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-2及IL-2、Fas L基因的表達(dá),PHA與PMA可以誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-2,及IL-2、Fas L基因的表達(dá),而DEX及DOC均抑制上述PHA或PHA與PMA誘導(dǎo)的IL-2的升高,及IL-2 m RNA和Fas L m RNA的水平的升高。DEX和DOC均可抑制野生型Fas L及NFκB報告基因表達(dá),但對于NF-κB位點(diǎn)突變的Fas L報告基因表達(dá)無作用。無論是DEX,還是DOC都沒有改變IL-2啟動子探針與NF-κB核蛋白復(fù)合體的結(jié)合。DEX和DOC也均沒有改變Fas L啟動子探針與NF-κB核蛋白復(fù)合體的結(jié)合。在轉(zhuǎn)染了顯性負(fù)突變MR基因的Jurkat細(xì)胞中,DOC對NF-κ報告基因的活性無作用,對Fas L報告基因的活性的抑制作用也消失。而DEX對Fas L報告基因及Fas L m RNA水平的影響也部分被抑制。結(jié)論:PHA和SEB均可以誘導(dǎo)的人原代培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。DEX和DOC通過抑制IL-2與Fas L的表達(dá)及IL-2的生成阻斷外源性凋亡路徑,保護(hù)激活誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡。GR與MR均可通過抑制NF-κB而下調(diào)Fas L轉(zhuǎn)錄,但對抗炎基因的作用不同,提示有著不同的作用機(jī)制。DOC抑制NF-κB信號路徑和Fas L的產(chǎn)生是經(jīng)典的核受體作用途徑,通過與MR形成配體-受體復(fù)合物發(fā)揮功能的。DOC的作用是MR依賴性的。MR配體可能成為阻斷膿毒癥和其他免疫異常疾病的副作用較小的理想治療藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R459.7

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本文編號：2417579