【摘要】：研究目的失血性休克常見于創(chuàng)傷和大手術,可以造成缺血/再灌注類型的損傷。失血性休克患者在接受二次打擊如感染時,更易發(fā)展為系統(tǒng)性炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)和多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome,MOF)。研究表明失血性休克可以通過預激活固有免疫系統(tǒng),放大炎癥反應,導致組織、器官損傷,然而其具體機制未明。并且在失血性休克的發(fā)展過程中巨噬細胞與中性粒細胞間的相互作用并不清楚,越來越多的研究表明外泌體可以介導細胞間的交流。我們通過對失血性休克過程中巨噬細胞對中性粒細胞死亡調控的研究,以探索失血性休克的發(fā)展機制,以期改善對手術、創(chuàng)傷病人致失血性休克的臨床干預。研究方法1.體內實驗采用失血性休克模型,將C57BL/6野生型、gp91基因敲除型小鼠隨機分為假手術組(Sham組)、失血性休克組(HS組)。對Sham組小鼠不抽取血液、不進行復蘇,其余實驗步驟與HS組相同。為了研究肺泡巨噬細胞對中性粒細胞死亡的作用,在失血性休克前24小時于氣管內注射Clodrosme以清除肺泡巨噬細胞。復蘇8小時后,處死小鼠,實施肺泡灌洗,進行后續(xù)實驗。2.體外實驗采用低氧/復氧培養(yǎng)條件下巨噬細胞與中性粒細胞共培養(yǎng)模型。低氧條件為在1%O2下培養(yǎng)15小時,在21%O2下培養(yǎng)5小時。對照組即為在21%O2下培養(yǎng)20小時。巨噬細胞與中性粒細胞均從小鼠骨髓提取,巨噬細胞在體外培養(yǎng)成熟后與中性粒細胞按1:1比例共培養(yǎng)。3.采用流式細胞術檢測小鼠肺泡灌洗液中和體外共培養(yǎng)后中性粒細胞7-AAD和Annexin V雙陽性細胞所占的比例;用激光共聚焦顯微鏡檢測中性粒細胞內RIPK1與RIPK3共定位情況;通過Western-Blot檢測中性粒細胞內RIPK1與MLKL磷酸化情況。以上檢測方法聯(lián)合使用可以判斷中性粒細胞是否處于壞死狀態(tài)。4.采用外泌體分離試劑盒(培養(yǎng)基專用)分離細胞培養(yǎng)基中的外泌體。用NTA檢測外泌體的大小,Lowry法對外泌體中蛋白進行定量,流式細胞術檢測外泌體標志物CD63的表達情況,電鏡下觀察外泌體的典型形態(tài)。研究結果1.在失血性休克模型中巨噬細胞促進中性粒細胞壞死。與假手術組(Sham組)相比,失血性休克組(HS組)肺泡灌洗液中性粒細胞7-aad和annexinv雙陽性所占的比例明顯升高(p0.01)。clodrosome氣管內注射后(clodrosome-hs組)肺泡灌洗液中中性粒細胞7-aad和annexinv雙陽性所占的比例較hs組明顯降低(p0.01)。通過激光共聚焦顯微鏡同樣檢測到hs組肺泡灌洗液中中性粒細胞內ripk1與ripk3共定位明顯增多;clodrosome清除肺泡巨噬細胞后,中性粒細胞內ripk1與ripk3共定位相較于hs組減少(p0.01)。2.在低氧/復氧模型中巨噬細胞促進中性粒細胞壞死。在低氧條件下與巨噬細胞共培養(yǎng)組(hypoxia+mφ組)中性粒細胞7-aad和annexinv雙陽性所占的比例較其它組明顯增高(p0.01),ripk1抑制劑nec-1可以抑制hypoxia+mφ組中性粒細胞壞死的增加(p0.01)。westernblot檢測到hypoxia+mφ組中性粒細胞內出現(xiàn)明顯的ripk1磷酸化條帶。通過激光共聚焦顯微鏡可以看到hypoxia+mφ組中性粒細胞內ripk1與ripk3共定位增加(p0.01)。3.在失血性休克模型中巨噬細胞釋放外泌體增加。用流式細胞術檢測肺泡灌洗液中外泌體標志物cd63平均熒光強度(mfi)。與假手術組(sham組)相比,失血性休克組(hs組)mfi明顯增高(p0.01);清除肺泡巨噬細胞后,外泌體含量較hs組減少(p0.01)。通過透射電鏡可以觀測到外泌體的雙層膜結構。4.在體外低氧/復氧模型中巨噬細胞外泌體分泌增加。用納米顆粒分析系統(tǒng)(nta)檢測我們自培養(yǎng)基中分離的外泌體,其平均直徑為39.86nm,占全部分離顆粒的85%。低氧培養(yǎng)條件下巨噬細胞分泌外泌體內蛋白含量為正常氧培養(yǎng)條件下的(4.16±0.35)倍(p0.01)。用流式細胞術檢測巨噬細胞外泌體標志物cd63表達強弱,低氧培養(yǎng)條件下巨噬細胞分泌外泌體表達cd63的平均熒光強度(mfi)較正常氧培養(yǎng)條件下明顯增高(p=0.009)。且激光共聚焦顯微鏡下可以觀察到中性粒細胞內攝取有巨噬細胞分泌的外泌體。5.外泌體分泌抑制劑能夠抑制低氧/復氧過程中巨噬細胞對中性粒細胞壞死的促進作用。外泌體分泌抑制劑dma能夠抑制低氧/復氧條件下與巨噬細胞共培養(yǎng)后(hypoxia+mφ+dma組)中性粒細胞7-aad和annexinv雙陽性細胞比例的增加,與hypoxia+mφ組相比差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。westernblot檢測到在低氧/復氧條件下與巨噬細胞共培養(yǎng)后,dma可以抑制中性粒細胞內ripk1、mlkl磷酸化。通過激光共聚焦顯微鏡檢測到dma可以抑制低氧/復氧條件下巨噬細胞促進的中性粒細胞內ripk1與ripk3共定位。6.低氧/復氧過程中巨噬細胞釋放外泌體促進中性粒細胞壞死。與低氧培養(yǎng)條件下巨噬細胞分泌的外泌體共培養(yǎng)組(hypoxia+exos組)中性粒細胞壞死水平較與正常氧培養(yǎng)條件下巨噬細胞分泌的外泌體共培養(yǎng)組(Normoxia+Exos組)明顯增加,且能為Nec-1所抑制(P0.01)。7.在低氧/復氧模型中巨噬細胞外泌體上調中性粒細胞內ROS水平。在低氧條件下與巨噬細胞共培養(yǎng)組(Hypoxia+Mφ組)中性粒細胞內ROS水平較其它組明顯升高(P0.01),且能被外泌體分泌抑制劑DMA所抑制。并且,與低氧培養(yǎng)條件下巨噬細胞分泌的外泌體共培養(yǎng)組(Hypoxia+Exos組)中性粒細胞內ROS水平較與正常氧培養(yǎng)條件下巨噬細胞分泌的外泌體共培養(yǎng)組(Normoxia+Exos組)明顯增加(P0.01)。8.低氧/復氧過程中巨噬細胞外泌體通過上調中性粒細胞內ROS水平促進其壞死。低氧培養(yǎng)條件下與巨噬細胞共培養(yǎng)時加入ROS清除劑NAC后(Hypoxia+Mφ+NAC組),中性粒細胞7-AAD和Annexin V雙陽性所較Hypoxia+Mφ組明顯下降(P0.01)。WT中性粒細胞與gp~(91~(phox-/-))巨噬細胞在低氧條件下共培養(yǎng)后,中性粒細胞壞死比例與中性粒細胞是WT型的其它組相比明顯升高(P0.01)。然而,當gp~(91~(phox-/-))中性粒細胞與WT巨噬細胞在低氧條件下共培養(yǎng)后,中性粒細胞7-AAD和Annexin V雙陽性所占的比例與中性粒細胞是gp~(91~(phox-/-))型的其它組相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。將低氧培養(yǎng)條件下巨噬細胞分泌的外泌體與gp~(91~(phox-/-))中性粒細胞共培養(yǎng),gp~(91~(phox-/-))中性粒細胞7-AAD和Annexin V雙陽性所占的比例較Hypoxia+Exos組明顯下降(P0.01)。且低氧培養(yǎng)條件下巨噬細胞分泌的外泌體不能上調gp~(91~(phox-/-))中性粒細胞內ROS水平(與Hypoxia+Exos組相比差異有統(tǒng)計學意義,P0.01)。9.NADPH氧化酶在失血性休克過程中性粒細胞壞死中具有重要作用。野生型小鼠(Wild Type,WT)失血性休克后肺泡灌洗液中中性粒細胞7-AAD和Annexin V雙陽性所占的比例較gp~(91~(phox-/-))小鼠明顯升高(P0.01)。WT小鼠失血性休克后肺泡灌洗液中中性粒細胞內RIPK1與RIPK3 Pearson共定位系數(shù)較gp~(91~(phox-/-))小鼠明顯升高(P0.01)。結論失血性休克過程中肺泡巨噬細胞促進中性粒細胞壞死,且巨噬細胞外泌體介導了這一過程。在體外低氧/復氧過程中ROS介導了巨噬細胞外泌體對中性粒細胞壞死的促進作用。NADPH氧化酶在失血性休克過程中性粒細胞壞死中具有重要作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R605.971

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本文編號：2339768