【摘要】：目的本課題旨在研究膿毒癥時(shí)腦組織高遷移率族蛋白B1 (HMGB1)表達(dá)和膽堿能神經(jīng)活性的變化規(guī)律,進(jìn)而探討中樞性HMGB1在膿毒痘免疫功能障礙中的作用及其與膽堿能抗炎通路的關(guān)系。方法1.將40只大鼠隨機(jī)分為正常組、假傷組、盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture, CLP) 24h組和CLP 48 h組。大鼠于CLP術(shù)后24 h、48 h處死,取出整腦并依次分離皮層、海馬、紋狀體和丘腦.采用蛋白印跡分析(Western blot)、PCR和組織免疫熒光檢測(cè)腦組織HMGB1的表達(dá)變化,采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)各腦區(qū)膽堿能活性指標(biāo)(AchE、Ach和ChAT)變化。2.將80只大鼠隨機(jī)分為正常組、假傷組、HMGB1 (1μg)組和HMGB1 (10μg)組,分24 h、48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),每組10只。 各紐大鼠分別于側(cè)腦室HMGB1刺激后24 h、48 h斷頸處死并立即于無菌超凈臺(tái)中消毒表面皮膚,無菌取出脾臟,分選出脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、樹突狀細(xì)胞(DC)和CD4+T細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)法(CCK8法)和ELISA法分別檢測(cè)Treg和DC表型、T細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞因子分泌的變化。3.將60只大鼠隨機(jī)分為正常組、假傷組(Sham+NS)、膿毒癥組(CLP+NS)和膿毒癥+BoxA組(CLP+BoxA),分24 h、48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),每組10只. 各組大鼠預(yù)先行側(cè)腦室置管,后分別行假傷或CLP術(shù)后立即給予側(cè)腦室(NS或BoxA),術(shù)后24 h、48 h斷頸處死并立即于無菌超凈臺(tái)中消毒表面皮膚,無菌取出脾臟,分選出脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、樹突狀細(xì)胞(DC)和CD4+T細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)法(CCK8法)和ELISA法分別檢測(cè)Treg和DC表型、T細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞因子分泌的變化。4.實(shí)驗(yàn)分為側(cè)腦室高遷注射和膿毒癥中樞BoxA干預(yù)兩部分。在側(cè)腦室高遷注射實(shí)驗(yàn)中,將16只野生型雄性C56BL/小鼠和16只α7 nAChR敲除雄性C56BL/6小鼠編號(hào)、稱重,按隨機(jī)原則分別分成對(duì)照組和HMGB1 1微克組,每組8只。在膿毒癥中樞BoxA干預(yù)實(shí)驗(yàn)中,將24只野生型雄性C56BL/小鼠和24只α7nAChR敲除雄性C56BL/6小鼠編號(hào)、稱重,按隨機(jī)原則分別分成假傷組、CLP組和CLP中樞BoxA干預(yù)組,每組8只。實(shí)驗(yàn)中各組小鼠的處理同前面實(shí)驗(yàn)部分,各組小鼠于術(shù)后24 h斷頸處死并立即于無菌超凈臺(tái)中消毒表面皮膚,無菌取出脾臟,分選出脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg),采用流式細(xì)胞術(shù)、CCK8法和ELISA法分別檢測(cè)Treg表型、T細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞因子分泌的變化。結(jié)果1.膿毒癥組與假傷組比較皮層、海馬、紋狀體、丘腦腦組織HMGB1表達(dá)明顯增加(皮層：P0.05；海馬：P0.05；紋狀體：P0.01；丘腦：P0.01)；膿毒癥24 h組與膿毒癥48 h相比,各部分組織HMGB1表達(dá)無明顯差異。膿毒癥組與假傷組比較各部分腦組織膽堿能活性指標(biāo)明顯增加：AchE(皮層：P0.05；海馬：P0.05；紋狀體：P0.05丘；腦：P0.05),Ach(皮層：P0.01；海馬：P0.01；紋狀體：P0.05丘；腦：P0.01),ChAT(皮層:P0.01；海馬：P0.01；紋狀體：P0.01丘；腦：P0.01)；膿毒癥24 h組與膿毒癥48 h相比,各部分組織膽堿能活性指標(biāo)無明顯差異。2.中樞HMGB1對(duì)大鼠外周Treg、DC和CID4+T細(xì)胞免疫功能的影響：(1)HMGB1 1μg組與假傷組比較Treg細(xì)胞Foxp3的表達(dá)和IL-10的分泌于48小時(shí)增加(P0.01-0.05); HMGB1 10μg組與假傷組比較Treg細(xì)胞Foxp3和CTLA-4表達(dá)上調(diào),對(duì)T細(xì)胞增殖抑制功能增強(qiáng), TGF-p和IL-10分泌增加,各指標(biāo)于24h和48h差異顯著(P均小于0.01).(2)HMGB1 1μg組與假傷組比較DC細(xì)胞CD80、MHCⅡ表達(dá)降低,于24和48h差異顯著(P均小于0.05)；HMGB1 10μg組與假傷組比較DC細(xì)胞CD80、CD86和MHC II表達(dá)降低,促T細(xì)胞增殖能力降低,各指標(biāo)于24和48h差異顯著(P均小于0.01)。(3)HMGB1lpg組與假傷組比較CD4+T細(xì)胞IFN-γ,分泌減少,IL-4分泌增加,各指標(biāo)于24h差異顯著(P均小于0.05)；HMGB1 10μg組與假傷組比較CD4+T細(xì)胞增殖活性減弱,IL-2和IFNq,分泌減少,IL-4分泌增加,各指標(biāo)于24和48h差異顯著(P均小于0.01)。3.中樞BoxA對(duì)膿毒癥大鼠外周Treg、DC和CD4+T細(xì)胞免疫功能的影響：(1)CLP組與假傷組比較Treg細(xì)胞Foxp3和CTLA-4表達(dá)上調(diào),對(duì)T細(xì)胞增殖抑制功能增強(qiáng), TGF-β和IL-10分泌增加,各指標(biāo)于24和48h差異顯著(P均小于0.01); CLP+BoxA組與CLP組比較Treg細(xì)胞Foxp3和CTLA-4表達(dá)下調(diào),對(duì)T細(xì)胞增殖抑制功能減弱,TGF-p和IL-10分泌減少,各指標(biāo)于24和48h有差異(P均小于0.01)。(2)CLP組與假傷組比較DC細(xì)胞CD80、CD86和MHCⅡ表達(dá)降低,促T細(xì)胞增殖能力減弱,各指標(biāo)于24和48h差異顯著(P均小于0.01)；CLP+BoxA組與CLP組比較DC細(xì)胞CD80、CD86和MHC II表達(dá)升高,促T細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),各指標(biāo)于24和48h有差異(P0.01-0.05)。(3)CLP組與假傷組比較CD4+T細(xì)胞增殖活性減弱,IL-2和IFN-γ分泌減少,IL-4分泌增加,各指標(biāo)于24和48h差異顯著(P均小于0.01); CLP+BoxA組與CLP組比較CD4+T細(xì)胞增殖增加,IL-2和IFN吖分泌增多,IL-4分泌減少,各指標(biāo)于24和48h有差異(P0.01-0.05)。4.a7 nAChR在膿毒癥時(shí)中樞HMGB1調(diào)節(jié)外周Treg細(xì)胞功能中的作用：(1)在野生型小鼠中,HMGB1刺激組與假傷組比較外周脾Treg細(xì)胞Foxp3和CTLA-4上調(diào),對(duì)T細(xì)胞抑制能力增強(qiáng),TGF-p和IL-10分泌增加(P均小于0.01)；在α7nAChR敲除小鼠中,HMGB1刺激組與假傷組比較外周脾Treg細(xì)胞Foxp3上調(diào)(P0.01),其余指標(biāo)無明顯差異.(2)在野生型小鼠中,CLP+BoxA組與CLP組比較Treg細(xì)胞Foxp3和CTLA-4表達(dá)減少,TGF-β和IL-10分泌減少,T細(xì)胞抑制功能減弱(P0.01-0.05)；在a7 nAChR敲除小鼠中,CLP+BoxA組與CLP組比較Treg細(xì)胞各指標(biāo)差異不明顯。結(jié)論1.膿毒癥時(shí)各腦區(qū)組織HMGB1表達(dá)增加,且膽堿能活性指標(biāo)水平升高；2.膿毒癥時(shí)中樞HMGB1的表達(dá)增加可導(dǎo)致脾Treg抑制功能增強(qiáng),介導(dǎo)DC和T細(xì)胞免疫功能受損;3中樞水平拮抗HMGB1可降低膿毒癥時(shí)脾Treg的抑制功能,改善DC和T細(xì)胞；4膿毒癥時(shí)中樞HMGB1可經(jīng)膽堿能抗炎通路調(diào)節(jié)外周Treg細(xì)胞功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R459.7

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本文編號(hào)：2336324