【摘要】：研究背景 成纖維細(xì)胞激活蛋白(Fibroblast activation protein, FAPa)是1986年由國(guó)外的學(xué)者Rettig等應(yīng)用單克隆抗體F19(用體外培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞免疫小鼠獲得)從人類惡性黑色素瘤細(xì)胞株LOX當(dāng)中識(shí)別的一種膜結(jié)合糖蛋白,它特異性表達(dá)活化的成纖維細(xì)胞(Fibroblast, FB)膜上,在正常成人靜息的FB上通常不表達(dá)或者表達(dá)水平很低。提示：FAPa是活化FB表面的標(biāo)志物,在控制FB生長(zhǎng)及胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和上皮性腫瘤的演進(jìn)過程中可能起一定的作用。 近三十年來,國(guó)內(nèi)外有關(guān)FAPa的研究工作逐漸開展,大部分集中在組織器官纖維化和上皮性腫瘤的研究領(lǐng)域。大量的研究報(bào)道,FAPa在大多數(shù)上皮性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用,其作用機(jī)制有以下幾種可能：(1)發(fā)揮其酶的功能,直接溶解與其相鄰的細(xì)胞外基質(zhì)成分,協(xié)助腫瘤細(xì)胞的侵襲和參與腫瘤組織的重塑；(2)解離與基質(zhì)蛋白結(jié)合的生長(zhǎng)因子,使之發(fā)揮促生長(zhǎng)作用；(3)參與腫瘤微血管的生成。目前FAPa已成為腫瘤治療的新型靶目標(biāo),成為腫瘤臨床與基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn),相關(guān)研究工作正在有序地開展,其中的不足之處仍在不斷改進(jìn)。 FB作為重要的組織修復(fù)細(xì)胞,以活化的形式參與創(chuàng)面修復(fù)的各個(gè)階段,在創(chuàng)面修復(fù)過程中起重要的作用。FAPa作為活化FB表面的標(biāo)志物,目前有關(guān)FAPa在創(chuàng)面修復(fù)與組織重建的研究領(lǐng)域開展較少,目前雖然已經(jīng)明確FAPa在創(chuàng)面修復(fù)的早期階段及后期的瘢痕組織中均有不同程度的表達(dá),但是FAPa在創(chuàng)面修復(fù)過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)特點(diǎn)、生理作用及調(diào)控機(jī)制,迄今未見系統(tǒng)的研究和闡明。 研究目的 1.觀測(cè)FAPa在大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面修復(fù)過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)特點(diǎn)。 2.觀測(cè)FAPa在成人病理性瘢痕組織中的表達(dá)特點(diǎn)。 3.初步探討FAPa在燙傷創(chuàng)面修復(fù)過程中可能的作用。 材料與方法 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：健康成年清潔級(jí)Wistar大鼠共48只,雌雄不限,體質(zhì)量200-220g(南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。按統(tǒng)計(jì)學(xué)分組要求,隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組6只,實(shí)驗(yàn)組42只。實(shí)驗(yàn)組分為燙傷后6h、12h,1d、3d、7d、14d、21d7個(gè)分組,每分組6只。 2.深Ⅱ度燙傷模型的建立與組織獲�。篧istar大鼠燙傷模型借鑒文獻(xiàn)設(shè)計(jì),于實(shí)驗(yàn)前一天背部脫毛,0.3%戊巴比妥鈉(1ml/kg)腹腔注射麻醉。室溫下,將盛有56ml去離子水,直徑約3.0cm的燒瓶放入恒溫水箱中,加熱至燒瓶?jī)?nèi)的溫度為95℃時(shí)取出燒瓶,在溫度為90℃時(shí),輕放在大鼠背部皮膚上15s,造成直徑約3.0cm大小的圓形深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面(經(jīng)病理驗(yàn)證為深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面)。傷后大鼠置室溫25℃環(huán)境中分籠飼養(yǎng),自由飲水、進(jìn)食,每天更換創(chuàng)面敷料一次。分別在傷后預(yù)定時(shí)間斷頭處死,取創(chuàng)面中央處1.0cm×1.Ocm全層皮膚組織,1/2放入4%中性多聚甲醛中固定,用于免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn),另1/2組織置于-80℃冰箱保存,用于Western blotting檢測(cè)試驗(yàn)。對(duì)照組背部脫毛后直接斷頭處死,取與實(shí)驗(yàn)組大鼠相同部位同等大小皮膚組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 3.病理性瘢痕組織的獲取：選擇南方醫(yī)院燒傷科因四肢深Ⅱ度燙傷后形成病理性瘢痕,需要手術(shù)治療的患者6例(診斷依靠病史及病理檢查,病變局部皮膚無破潰,患者無全身疾病),男女各半,年齡18-60歲,瘢痕形成時(shí)間10-14個(gè)月。在征得病人及其家屬同意后,手術(shù)切除病理性瘢痕的同時(shí),在其周邊取少許正常皮膚組織作對(duì)照,標(biāo)本置于-80℃冰箱保存,用于Western blotting檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。 4.觀測(cè)方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)和Western blotting技術(shù)對(duì)FAPa的表達(dá)進(jìn)行定位和半定量檢測(cè)。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,對(duì)大鼠燙傷創(chuàng)面FAPa的灰度值行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布、方差齊性。對(duì)大鼠燙傷創(chuàng)面修復(fù)過程中不同時(shí)間點(diǎn)FAPa的灰度值的統(tǒng)計(jì)分析采用one-way ANOVA,進(jìn)一步多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)；成人病理性瘢痕組織及其周圍正常皮膚組織FAPa灰度值的統(tǒng)計(jì)分析,采用配對(duì)t檢驗(yàn)。顯著性檢驗(yàn)水平α=0.05,當(dāng)P0.05時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.免疫組織化學(xué)技術(shù)測(cè)得FAPa (+)的成纖維細(xì)胞被DAB染成棕色定位在創(chuàng)面真皮血管以及新生血管的血管壁和血管周圍。 2.以β-actin為內(nèi)參,Western blotting技術(shù)測(cè)得對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠背部皮膚組織FAPa的灰度值分別為31.67±3.20,84.67±8.71,106.00±11.75,118.33±13.44,117.33±8.62,140.33±15.92,106.17±15.77,79.83±9.30。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)FAPa的灰度值與對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)FAPa灰度值的總體均數(shù)不全相等,其中12h與1d,1d與3d比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余時(shí)間點(diǎn)FAPa的灰度值與相鄰時(shí)間點(diǎn)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.以β-actin為內(nèi)參,Western blotting技術(shù)測(cè)得成人正常皮膚組織與病理性瘢痕組織中FAPa的灰度值分別為18.00±7.87,47.17±10.09,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 1. FAPa在大鼠正常皮膚組織中也有表達(dá),深Ⅱ度燙傷后6h, FAPa的表達(dá)量已明顯增多,6h以后FAPa的表達(dá)量逐漸增多,并在燙傷后第7d達(dá)到高峰,7d后FAPa的表達(dá)量逐漸減少,至傷后第21d FAPa仍有較高水平的表達(dá)。 2. FAPa在成人正常皮膚與病理性瘢痕組織中均有表達(dá),病理性瘢痕組織中的表達(dá)量高于正常皮膚組織。 3. FAPa在深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面修復(fù)過程中的表達(dá)特點(diǎn)與創(chuàng)面修復(fù)的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、創(chuàng)面收縮和再塑形幾個(gè)階段成纖維細(xì)胞的活動(dòng)特點(diǎn)存在密切關(guān)系。提示,FAPa在燙傷創(chuàng)面修復(fù)過程中起一定作用。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R644

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2335508