【摘要】：研究背景： 創(chuàng)面愈合是皮膚出現(xiàn)缺損后，局部組織通過遷移、增殖、重塑，進行修復的病理生理過程。這一過程需要各種修復細胞與一系列細胞因子的相互作用來調(diào)控，其中成纖維細胞是重構真皮的主要效應細胞。因此，發(fā)生在成纖維細胞與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）之間的大量復雜的生物反應是研究傷口愈合病理過程的重要部分。 ECM作用于細胞膜的主要受體是整合素，研究表明傷口愈合過程中會出現(xiàn)多種整合素表達增強，推測整合素可能參與創(chuàng)傷愈合過程的調(diào)控。整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）連接整合素胞內(nèi)結構并促進細胞信號的級聯(lián)反應。實驗表明利用小分子干擾技術（siRNA）下調(diào)ILK蛋白的表達后可抑制腫瘤細胞的侵襲和惡化。另外，有研究發(fā)現(xiàn)ILK在轉化生長因子β1（transformationgrowth factor beta1，TGF-β1）誘導小鼠腎臟纖維化進程中起重要作用。創(chuàng)面愈合肉芽組織形成的病理特征也是ECM沉積和成纖維細胞分化增生。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面愈合與ILK的表達密切相關，但對ILK在創(chuàng)面愈合的作用和影響機制尚需進一步探討。 根據(jù)ILK蛋白氨基酸排列的特點，人工合成的蛋白小分子QLT0267能與胞漿中的ILK特異性結合并阻斷其Ser473磷酸化位點，抑制其對蛋白激酶B（PKB/AKT）的磷酸化，降低磷酸化AKT（phosphorylation of AKT，pAKT）的量，調(diào)控細胞生物學改變。研究發(fā)現(xiàn)ILK特異性阻斷劑QLT0267能有效地降低pAKT的蛋白量，影響腫瘤細胞、腎小管上皮細胞的遷移、分化增生和凋亡，推論ILK通過ILK-PKB/AKT途徑調(diào)控細胞生理功能。ILK特異性抑制劑QLT0267的應用為研究ILK在創(chuàng)面愈合的作用機制提供了新的方向。 本研究以人皮膚成纖維細胞為研究對象，應用QLT0267抑制ILK磷酸化AKT；同時利用siRNA技術降低ILK蛋白的表達，觀察成纖維細胞的遷移和分化功能的改變，初步探討ILK在創(chuàng)面愈合過程中的作用。 第一部分不同濃度ILK特異性抑制劑QLT0267對人皮膚成纖維細胞的影響 目的觀察不同濃度的ILK特異性抑制劑QLT0267在不同時間點對成纖維細胞生物學特征的改變，確定后續(xù)實驗的最佳藥物濃度及觀察時間點。 方法收集整形術后剩余的皮膚標本，采用機械法加酶消化法分離培養(yǎng)成纖維細胞，利用ILK特異性抑制劑QLT0267降低ｐAKT的量，以不同終濃度藥物作用于成纖維細胞，實驗分為A空白對照組、B5nM QLT0267組、C10nMQLT0267組、D20nM QLT0267組、E30nM QLT0267組和F DMSO組（QLT0267溶劑）。分別于12、24、48、72h在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)；CellTiter試劑盒檢測24、48、72h時間點各組的增殖情況，并與空白對照組比較計算增殖抑制率；流式細胞儀檢測48h時間點細胞凋亡情況，同時Western Blot法觀察pAKT、tAKT蛋白的表達。對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和重復測量設計方差分析檢驗。 結果經(jīng)濃度大于10nM的ILK特異性抑制劑作用下成纖維細胞膨脹變圓，核固縮或破碎，并出現(xiàn)細胞凋亡，隨藥物刺激時間的延長和藥物濃度的增加，改變更加明顯。CellTiter試劑盒檢測結果顯示10nM以上的ILK特異性抑制劑QLT0267能抑制成纖維細胞的增殖（P＜0.05），且隨著濃度的增高和刺激時間的延長，增殖抑制率也提高（P＜0.05）。流式細胞儀檢測結果顯示與對照組相比較，10nM以上的ILK特異性抑制劑能誘導的成纖維細胞凋亡（P＜0.05）。Western Blot結果顯示各藥物濃度組的pAKT表達比空白對照組低，并隨著藥物濃度的上升而下降（P＜0.05）。各組成纖維細胞表達tAKT蛋白量的差異無統(tǒng)計學差異（P＞0．05）。 結論ILK特異性抑制劑QLT0267能誘導成纖維細胞生物學特性的改變，通過降低pAKT的量而抑制細胞增殖、啟動細胞凋亡。隨著藥物濃度的升高和刺激時間的延長，效果更明顯。根據(jù)以上實驗結果和后續(xù)實驗要求，應用10nMQLT0267成纖維細胞刺激48h是后續(xù)實驗的最佳實驗條件。 第二部分ILK對人皮膚成纖維細胞遷移能力的影響 目的探討ILK影響人皮膚成纖維細胞遷移能力的作用機制。 方法體外培養(yǎng)成纖維細胞，設計及合成靶向ILK基因的siRNA序列，Lipofectamine2000轉染試劑介導ILK-siRNA轉染成纖維細胞以及采用終濃度為10nM ILK特異性抑制劑QLT0267刺激細胞48h。實驗分為以下6組：A空白對照組、B轉染載體組（Lipofectamine2000轉染試劑）、C con-siRNA組、DILK-siRNA組、E ILK活性抑制組和F DMSO組（QLT0267溶劑）。以上各組行體外細胞劃痕試驗，目鏡下觀察劃痕后0、12、24h時間點各組成纖維細胞向劃痕區(qū)遷移的面積，計算細胞愈合率；RT-PCR檢測各組細胞ILKmRNA的表達；Western Blot檢測各組細胞ILK、 pAKT、tAKT蛋白的表達。對數(shù)據(jù)行單因素方差分析和LSD-t檢驗。 結果體外細胞劃痕實驗結果顯示劃痕12h后ILK-siRNA組和ILK活性抑制組細胞愈合率顯著低于空白對照組（P＜0.01），，兩組組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。RT-PCR結果顯示與空白對照組比較，通過小分子干擾能顯著地抑制ILK基因的表達（P＜0.01）。Western Blot結果顯示ILK-siRNA組ILK表達比其余各組顯著降低（P＜0.01）；ILK-siRNA組與ILK活性抑制組的pAKT表達比其余各組降低（P＜0.05），兩組組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；tAKT的表達各組均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。 結論應用小分子干擾技術能下調(diào)ILK蛋白的表達下調(diào)，而ILK蛋白的降低或磷酸化活性被抑制，均能降低pAKT蛋白的表達量。結合體外細胞劃痕實驗結果，推論ILK可能通過ILK-AKT途徑影響成纖維細胞的遷移功能。 第三部分ILK對TGF-β1刺激人皮膚成纖維細胞上調(diào)α肌動蛋白的影響 目的探討ILK對TGF-β1誘導成纖維細胞合成α-肌動蛋白（alpha-smoothmuscle actin，α-SMA）的影響，探討ILK在成纖維細胞分化過程的作用。 方法實驗分為以下6組：A空白對照組、B轉染載體組（Lipofectamine2000轉染試劑）、C con-siRNA組、D ILK-siRNA組、E ILK活性抑制組和F DMSO組（QLT0267溶劑）。Western Blot檢測各組成纖維細胞α-SMA蛋白的表達。再取常規(guī)培養(yǎng)成纖維細胞分為以下7組：1. TGF-β1組、2.轉染載體+TGF-β1組、3.con-siRNA+TGF-β1組、4. ILK-siRNA+TGF-β1組、5. ILK活性抑制+TGF-β1組、6. DMSO+TGF-β1組、7.空白對照組。應用小分子干擾沉默ILK蛋白表達以及利用ILK特異性抑制劑QLT0267抑制ILK磷酸化活性，按第二部實驗分組方法處理1~6組后，再用5ng/ml TGF-β1加入1~6組刺激24h，Western Blot檢測各組α-SMA、ILK蛋白的改變。數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和t檢驗。 結果ILK-siRNA組和ILK活性抑制組的α-SMA蛋白比空白對照組明顯低（P0.05），兩者之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。TGF-β1組的α-SMA比空白對照組有所上升（P0.05）。ILK-siRNA+TGF-β1組的ILK比TGF-β1組低（P0.05）。ILK-siRNA+TGF-β1組和ILK活性抑制+TGF-β1組的α-SMA蛋白比TGF-β1組低（P0.05），兩者之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 結論ILK蛋白下調(diào)或其磷酸化活性受限能降低成纖維細胞合成α-SMA蛋白。TGF-β1可刺激成纖維細胞加快向肌成纖維細胞方向分化，但ILK表達下調(diào)或ILK活性受抑制均可減弱其刺激成纖維細胞分化的作用，推斷ILK通過參與TGF-β1誘導成纖維細胞的分化而影響創(chuàng)面愈合的效果。
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【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R641

【參考文獻】

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1 李罡;李葉揚;米蘭;孫敬恩;潘姝;戴麗冰;;整合素連接激酶和β_1整合素在大鼠燙傷創(chuàng)面愈合過程中表達的實驗研究[J];中華損傷與修復雜志(電子版);2009年04期

本文編號：2306986