【摘要】：研究目的：本實驗利用液壓打擊裝置成功建立大鼠顱腦創(chuàng)傷模型,并運用此模型進行：(1)、給與亞低溫(mild hypothermia, MHT)、促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)治療后,觀察亞低溫(MHT)、促紅細胞生成素(EPO)單獨及兩者聯(lián)合治療對顱腦創(chuàng)傷大鼠神經(jīng)功能缺陷評分、腦組織含水量、血腦屏障通透性的影響,探索亞低溫(MHT)聯(lián)合促紅細胞生成素(EPO)應用的腦保護作用；(2)、給與亞低溫(MHT)、促紅細胞生成素(EPO)單獨及兩者聯(lián)合治療后,測定損傷灶周圍腦組織AKT、pAKT、GSK3β、pGSK3β、Claudin-5及Caspase-3的含量變化,從而探索其與腦保護作用之間的關系及聯(lián)合應用亞低溫(MHT)、促紅細胞生成素(EPO)腦保護作用的可能機制,為臨床應用提供可靠的理論依據(jù)。 研究內(nèi)容與方法：本實驗分為兩個部分：試驗一, MHT聯(lián)合EPO治療的腦保護作用的研究。實驗二, MHT聯(lián)合EPO治療對顱腦創(chuàng)傷大鼠腦組織中AKT、pAKT、GSK3β、pGSK3β、Claudin-5及Caspase-3表達的影響。 試驗一：采用健康成年雄性Wistar大鼠40只,隨機分成5組：假手術組(Sham組)僅做傷前準備而不予液壓打擊、常溫治療組(NT組)只致傷不降溫、亞低溫治療組(MHT組)給予亞低溫治療、促紅細胞生成素治療組(EPO組)與規(guī)定時間給與EPO腹腔注射治療、亞低溫聯(lián)合促紅細胞生成素治療組(MHT+EPO組)給與亞低溫治療,并在規(guī)定時間給與EPO腹腔注射治療。術后48h所有大鼠進行神經(jīng)功能評分(n=8),完畢后所有大鼠斷頭處死,干/濕比重法測定腦組織含水量(n=4);EvanS藍測定法測定血腦屏障通透性改變(n=4)。 實驗二：采用健康成年雄性Wistar大鼠50只,隨機分成5組：假手術組(Sham組)僅做傷前準備而不予液壓打擊、常溫治療組(NT組)只致傷不降溫、亞低溫治療組(MHT組)給予亞低溫治療、促紅細胞生成素治療組(EPO組)與規(guī)定時間給與EPO腹腔注射治療、亞低溫聯(lián)合促紅細胞生成素治療組(MHT+EPO組)給與亞低溫治療,并在規(guī)定時間給與EPO腹腔注射治療。術后48h所有大鼠斷頭處死,采用HE染色法觀察損傷病灶大小(n=3),采用蛋白印跡法(Western Blotting法)(n=3)和實時定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應法(Real-time qPCR法)(n=4)分別測定腦組織AKT、pAKT、GSK3β、pGSK3β、Claudin-5及Caspase-3的表達情況,采用免疫組織化學方法測定腦組織中pAKT、pGSK3(3表達情況。 結(jié)果：1.神經(jīng)功能缺陷評分結(jié)果：依據(jù)改良神經(jīng)功能損傷程度評分(mNSS)測定各組大鼠神經(jīng)功能改變,與Sham組相比,其余四組神經(jīng)功能缺陷評分明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義(均P0.05),與NT組相比MHT組、EPO組及MHT+EPO組神經(jīng)功能缺損評分均有明顯減低(*P0.05,**P0.01)；與MHT組、EPO組相比MHT+EPO組神經(jīng)功能缺陷評分明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(#P0.05)。 2.腦組織含水量測定結(jié)果：利用干/濕重法檢測腦組織含水量,Sham組腦組織含水量為77.16±2.11%,NT組為83.23±1.99%；與NT組相比,MHT組、EPO組、MHT+EPO組腦組織含水量降低并具有統(tǒng)計學差異(NT vs. EPO,83.23±1.99%vs.80.43±2.38%; NT vs. MHT,83.23±1.99%vs.79.85±1.78%;NT vs. MHT+EPO,83.23±1.99%vs.78.12±1.34%)(P＜0.05,P＜0.01);與MHT組、EPO組相比,MHT+EPO組腦組織含水量降低并具有統(tǒng)計學差異(MHT vs. MHT+EPO,79.85±1.78%vs.78.12±1.34%;EPO vs. MHT+EPO,80.43±2.38%vs.78.12±1.34%)(#P＜0.05)。 3.血腦屏障(BBB)通透性測定結(jié)果：Evans藍測定法檢測BBB通透性,造模成功后,各組BBB通透性均增加(均P0.05),與NT組相比,MHT組、EPO組及MHT+EPO組BBB通透性減低,差異具有統(tǒng)計學意義(*P0.05,P0.01)；與MHT組、EPO組相比,MHT+EPO治療組降低BBB通透性的作用更加顯著(#P0.05)。 4.HE染色結(jié)果：NT組皮層損傷灶明顯,灶內(nèi)可見大量細胞核碎片聚集,海馬部位神經(jīng)細胞有胞體固縮,胞核不清、核拉長或呈三角形等不同程度損傷改變。與NT組相比MHT組、EPO組及MHT+EPO組皮層損傷灶減小,海馬部位神經(jīng)細胞有胞體固縮／胞核變形情況明顯減少。 5.亞低溫(MHT)、促紅細胞生成素(EPO)單獨及聯(lián)合應用對顱腦創(chuàng)傷大鼠腦組織中AKT、pAKT、GSK3β、pGSK3β、Claudin-5及Caspase-3表達的影響：與NT組相比MHT組、EPO組及MHT+EPO組pAkt、pGSK3β、Claudin-5在蛋白水平表達明顯升高,并差異具有統(tǒng)計學意義(*P0.05,**P0.01),而AKT、GSK3β在各組之問的表達差異無統(tǒng)計學意義(均為P0.05)；MHT組、EPO組及MHT+EPO組Claudin-5轉(zhuǎn)錄水平較NT組明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義(*P0.05,**P0.01),且MHT+EPO組Claudin-5轉(zhuǎn)錄水平較MHT組、EPO組明顯增加(#P＜0.05,##P＜0.01);MHT組、EPO組及MHT+EPO組Caspase-3轉(zhuǎn)錄水平較NT組明顯降低(*P0.05,**P0.01),且MHT+EPO組Claudin-5轉(zhuǎn)錄水平較MHT組、EPO組減低明顯(#P0.05,##P0.01)。 結(jié)論：亞低溫(MHT)及促紅細胞生成素(EPO)均可降低顱腦創(chuàng)傷大鼠神經(jīng)功能缺陷評分,減輕腦組織水腫,降低血腦屏障(BBB)通透性,上調(diào)了pAkt、 pGSK3β、Claudin-5的表達水平,并降低Caspase-3的表達水平,對顱腦創(chuàng)傷大鼠腦組織有保護作用,并且兩種治療聯(lián)合應用上述作用更加明顯。本研究提示PI3K/Akt/GSK3β信號通路參與了亞低溫(MHT)、促紅細胞生成素(EPO)的腦保護作用,為亞低溫(MHT)、促紅細胞生成素(EPO)的臨床應用及推廣提供了理論基礎。
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【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R651.15

【參考文獻】

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本文編號：2304810