【摘要】：研究背景和目的 外傷性腦損傷(Traumatic Brain Injury, TBI)是指因外部原因引起的腦功能或腦病理學的改變,是世界性的公共衛(wèi)生問題。現(xiàn)有的針對TBI的治療尚不能徹底恢復受損的神經(jīng)功能。研究證實,成體腦內尚存在具有產(chǎn)生新生神經(jīng)元功能的細胞。但是,從患者恢復的結果來看,這種內源性神經(jīng)修復功能的效果是不足的。在過去的幾十年里,干細胞替代治療逐漸成為治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷的熱點,并且在世界范圍內進行了廣泛的研究。間充質干細胞(Mesenchymal Stromal Cell, MSC)由于其具有獲取容易,且?guī)缀醮嬖谟谒薪M織中,例如骨髓、脂肪組織、臍帶、新生兒肝臟、肌肉及肺部等,并且容易體外擴增等特點,從而成為干細胞治療的主力軍[3-5]。 目前已經(jīng)有諸多動物實驗證實MSC,對TBI、腦中風、神經(jīng)退行性疾病等具有治療作用[6-10]。目前認為MSC通過分泌一系列因子,達到促進神經(jīng)發(fā)生(Neurogenesis)、血管發(fā)生(Angiogenesis),減輕細胞凋亡,控制炎癥的目的。 重復經(jīng)顱磁刺激Repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS),作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新的研究工具,近二十年慢慢用于臨床。因其無創(chuàng)、簡單易行、較好的定位性,無需進行大量臨床前研究即可用于臨床,因此廣泛應用于臨床多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷、治療以及研究。大量臨床研究證實TMS能夠改善腦外傷患者的康復。TMS治療腦外傷的機制雖然尚不完全清楚,但目前的觀點認為主要通過對神經(jīng)興奮性的調控,表現(xiàn)為長時程增強(Long-term Potentiation, LTP)/長時程抑制(Long-term Depression, LTD)來發(fā)揮其治療作用。一般認為高頻rTMS能夠誘導LTP,從而改善TBI后神經(jīng)功能的恢復。 目前尚無TMS聯(lián)合MSC治療TBI的研究,本研究將首次探索MSC腦內移植,聯(lián)合rTMS干預治療對TBI后大鼠腦內神經(jīng)發(fā)生、損傷灶周邊凋亡機制進行探索。 方法 成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,體重210-249g,利用Feeney自由落體法制作大鼠TBI模型。用改良神經(jīng)功能嚴重程度評分(mNSS)評價大鼠造模術后第1、7、14及28天的行為學表現(xiàn)。根據(jù)POI評分,將大鼠分層隨機分為①單純損傷組；②損傷+TMS組；③損傷+hAD-MSC組；④損傷+TMS+hAD-MSC組。于術后第2天開始TMS,具體參數(shù)如下：放電電壓700V,頻率5Hz,第②、③組每只大鼠每日接受900個脈沖刺激。于術后第2天行hAD-MSC腦內植入術,第③、④大鼠各植入hAD-MSC5*105。分別在術后第7、14及28天三個時間點將大鼠分批處死,予生理鹽水、4%多聚甲醛心臟灌流后取腦,石蠟包埋切片,行HE和免疫組化染色。免疫組化指標：細胞增殖標記物BrdU,神經(jīng)干細胞及祖細胞標記物musashil,成熟神經(jīng)元標記物NeuN,細胞凋亡標記物caspase-3, hAD-MSC標志物抗人核單克隆抗體。部分大鼠在P02、P05和P013行18F-FDG micro-PET檢查。 結果 1、P02開始,TMS干預組較無TMS干預組能夠顯著降低TBI后大鼠死亡率(two-way ANOVA, p=0.025); PO14起TMS有改善TBI后大鼠行為學評分的趨勢(two-way ANOVA, p=0.104),表現(xiàn)為mNSS的降低。P028開始,TMS能夠顯著降低TBI后大鼠損傷側腦實質的減少(two-way ANOVA, p=0.045)。PO13開始,TMS有提高TBI后大鼠損傷灶周邊代謝的趨勢(two-way ANOVA, p=0.075)。尚不能證明TMS具有促進TBI后大鼠內源性神經(jīng)發(fā)生,以及抑制損傷灶周邊細胞凋亡的作用。 2、P02開始,MSC干預組較無MSC干預組能夠降低TBI后大鼠死亡率,但無統(tǒng)計學差異(two-way ANOVA, p=0.800); PO14起MSC有改善TBI后大鼠行為學評分的趨勢(two-way ANOVA, p=0.179),表現(xiàn)為mNSS的降低。P028開始,MSC有降低TBI后大鼠損傷側腦實質的減少的趨勢(two-way ANO VA,p=0.181)。PO13開始,MSC有提高TBI后大鼠損傷灶周邊代謝的趨勢(two-way ANOVA, p=0.136)。P028開始,MSC有顯著促進TBI后大鼠SVZ區(qū)細胞增殖的作用,表現(xiàn)為BrdU+細胞計數(shù)較無MSC組的升高(two-way ANOVA, p=0.012),但Musashil染色并無顯著差異。尚不能證明MSC具有促進TBI后大鼠內源性神經(jīng)發(fā)生、以及抑制損傷灶周邊細胞凋亡的作用。 3、研究尚不能證明TMS與MSC之間在治療TBI后大鼠上有相互協(xié)同或相互抑制的作用。 4、抗人核單克隆抗體追蹤植入TBI后大鼠腦內hAD-MSC結果顯示,移植后28d仍有絕大多數(shù)大鼠可檢測到存活hAD-MSC。存活的hAD-MSC幾乎全部分布于梗死灶周邊。 結論 1.腦內移植hAD-MSC具有顯著提高SVZ區(qū)細胞增殖的作用,以及具有改善損傷灶周圍腦代謝及減少TBI后腦實質的減少的趨勢。尚不能證明hAD-MSC有降低損傷灶周邊細胞凋亡的作用。 2.TMS能夠顯著降低TBI大鼠的死亡率及TBI后腦實質的減少,并且有改善損傷灶周圍腦代謝的趨勢,這種作用可能與TMS改善損傷灶周圍血供、降低炎癥反應相關。該研究尚不能證明TMS有促進內源性神經(jīng)發(fā)生、降低損傷灶周邊細胞凋亡的作用。 3. hAD-MSC*TMS二者之間沒有顯著的交互作用。 4. hAD-MSC移植到腦內后幾乎全部分布于損傷灶周邊,至術后28天絕大多數(shù)大鼠仍可檢測到hAD-MSC的存活。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R651.15

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本文編號：2260493