本文選題：膽堿能抗炎通路 + 膿毒癥��； 參考：《武漢大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的：既往研究發(fā)現(xiàn),miRNA在膽堿能抗炎通路中參與早期炎癥TNFa和IL-6的調(diào)控,而晚期炎癥因子是膿毒癥持續(xù)發(fā)生的基礎(chǔ)。本研究目的為：(1)膽堿能抗炎通路作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié),與miRNA調(diào)節(jié)方式相同,那么在膽堿能抗炎通路中是否存在調(diào)節(jié)晚期炎癥因子HMGB1的miRNA,利用miRNA芯片篩選確定差異miRNA。(2)從細(xì)胞學(xué)水平驗(yàn)證篩選的niRNA能靶向調(diào)節(jié)HMGB1。(3)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn),在組織學(xué)水平判斷目的miRNA在體內(nèi)能發(fā)揮膽堿能抗炎通路的作用,并對(duì)各器官中調(diào)節(jié)作用的差異進(jìn)行研究。方法：(1)利用miRNA芯片篩選RAW264.7在膿毒癥和膽堿能抗炎通路中,晚期炎癥因子表達(dá)高峰時(shí)miRNA表達(dá)的差異,利用差異倍數(shù)值(Fold change, Fc)找出在膽堿能抗炎通路中表達(dá)升高大于膿毒癥組2倍以上的目的miRNA, GeneSpring 12.5軟件,分別用PITA, TargetScan, microRNAorg三個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)符合要求的差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),選出三個(gè)數(shù)據(jù)庫篩選出基因的交集,進(jìn)行后續(xù)的基因本體(Gene Ontology, GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)的富集分析研究。(2) Real-time PCR驗(yàn)證目的miRNA芯片表達(dá)的準(zhǔn)確性。利用miR-205 mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染RAW264.7,通過對(duì)膿毒癥組和膽堿能抗炎通路組miR-205、 HMGB1和HMGB1 mRNA的表達(dá)驗(yàn)證miRNA作用的靶基因。(3)檢測(cè)膿毒癥小鼠和膽堿能抗炎通路小鼠血清、腦、心、肺、腎、肝、脾、大腸組織中miRNA、HMGB1和HMGB1 mRNA表達(dá)的差異,觀察miRNA在組織中的抗炎作用。結(jié)果：(1)本研究優(yōu)化了RAW264.7細(xì)胞膿毒癥LPS濃度和激活膽堿能抗炎通路的GTS-21藥物劑量,分別是50ng/ml和8μg/ml。BALB-c小鼠的最佳藥物劑量LPS為15mg/kg,GTS-21為4mg/kg。(2)利用差異倍數(shù)值,在膽堿能抗炎通路中表達(dá)升高大于膿毒癥組2倍以上的目的miRNA共38個(gè),其中只在膽堿能抗炎通路中升高的miRNA有4個(gè),分別是miR0205、196a、193b、31。對(duì)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)出2019個(gè)靶基因分布于66條通路。(3)選取膽堿能抗炎通路組濃度升高倍數(shù)較大的miR-205進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,與芯片的檢測(cè)結(jié)果一致。通過對(duì)RAW264.7轉(zhuǎn)染miR-205 mimics和inhibitor,轉(zhuǎn)染miR-205 mimics的RAW264.7加入LPS后HMGB1表達(dá)顯著低于膿毒癥組；轉(zhuǎn)染miR-205 inhibitor組加入LPS+GTS-21抗炎作用消失,HMGB1表達(dá)明顯升高。兩組HMGB1 mRNA表達(dá)差異沒有顯著性。(4)在對(duì)血清、肺、肝臟、脾臟、大腸、腦、腎、心臟等組織的膿毒癥組和膽堿能抗炎通路組miR-205做qRT-PCR檢測(cè),觀察兩組不同組織中miR-205的表達(dá)變化。檢測(cè)的8個(gè)器官的組織表達(dá)差異均有顯著性。膽堿能抗炎通路組的miR-205比sepsis組明顯升高。其中GTS-21組中血清、肝、腸、的組織表達(dá)超過sepsis組3倍以上。而腦、腎組織的miR-205在CAP組表達(dá)升高2倍左右,在心肌組織中升高不足一倍。血清、腦、腎、腸組織,p0.0001；肝p=0.0011,脾p=0.0054,心p=0.0049肺p=0.0032。用ELISA法對(duì)各組織中HMGB1濃度檢測(cè),膽堿能抗炎通路組各器官HMGB1較膿毒癥組表達(dá)下降。血清p=0.0063,腦、腎p0.0001,心p=0.0561,腸p=0.0068,肺p=0.0010,脾p=0.0090,肝p=0.0006。膿毒癥組和膽堿能抗炎通路組HMGB1 mRNA表達(dá)差異沒有顯著性(p0.05)。結(jié)論：(1)通過miRNA芯片對(duì)激活膽堿能抗炎通路時(shí)調(diào)控晚期炎癥因子的miRNA進(jìn)行首次全基因譜篩選。發(fā)現(xiàn)至少有4個(gè)miRNA與晚期炎癥因子表達(dá)調(diào)控有關(guān),分別是miR-205、miR-193b、miR-196a和miR-31。預(yù)測(cè)出2019種靶基因并進(jìn)行KEGG分析,共得到66條有意義的通路。(2)通過miR-205 mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染RAW264.7,證明miR-205在膽堿能抗炎通路中靶基因?yàn)镠MGB1。(3)通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-205的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后。(4)miR-205在不同組織中,表達(dá)量和降低HMGB1的作用均不相同。
[Abstract]:Objective : To investigate the role of miRNA in the early stage of inflammatory TNFa and IL - 6 in the anti - inflammatory pathway of cholinergic anti - inflammatory pathway . Results : ( 1 ) The results showed that : ( 1 ) The level of LPS in the anti - inflammatory pathway of cholinergic anti - inflammatory pathway was 15 mg / kg and 4 mg / kg respectively . Results : ( 1 ) The results showed that : ( 1 ) The optimal dose of LPS in BALB / c mice was 15 mg / kg and 4 mg / kg , respectively .
The expression of miR - 205 in serum , lung , liver , spleen , large intestine , brain , kidney , heart and other tissues was significantly higher than that in sepsis group .
Conclusion : ( 1 ) There is no significant difference ( p = 0.0063 ) , brain ( p = 0.0068 ) , lung p = 0.0010 , spleen ( p = 0.0090 ) , liver p = 0.0006 ) , lung p = 0.0010 , spleen p = 0.0090 , liver p = 0.0006 . The expression of miR - 205 in the anti - inflammatory pathway of cholinergic anti - inflammatory pathway is not significant ( p = 0.0090 , P = 0.0006 ) .
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R459.7

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本文編號(hào)：1957218