發(fā)布時(shí)間：2018-05-20 23:38

  本文選題：創(chuàng)傷 + 膿毒癥　； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景 創(chuàng)傷是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的公共衛(wèi)生難題，是45歲以下人群的主要死亡原因。創(chuàng)傷引發(fā)的膿毒癥和多器官功能障礙(MODS)等并發(fā)癥是患者死亡的嚴(yán)重威脅。因此，如何盡早甄別出罹患膿毒癥和MODS的高�；颊撸o予及早預(yù)防和針對(duì)性治療是提高嚴(yán)重創(chuàng)傷患者預(yù)后的關(guān)鍵。臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明創(chuàng)傷后機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)具有個(gè)體異質(zhì)性，創(chuàng)傷膿毒癥和MODS的發(fā)生與機(jī)體遺傳背景尤其是單核甘酸多態(tài)性存在密切的內(nèi)在聯(lián)系，即不同遺傳背景的創(chuàng)傷個(gè)體，存在膿毒癥易患性、臨床嚴(yán)重程度與預(yù)后及治療反應(yīng)的差異性。因此，從遺傳背景著手深入研究創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)規(guī)律、膿毒癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)遺傳信息，將為評(píng)估和預(yù)警創(chuàng)傷膿毒癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)性、治療反應(yīng)或預(yù)后建立有效、快捷的分子遺傳學(xué)診斷指標(biāo)和技術(shù)。 本研究目的是探索和發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷膿毒癥易患性相關(guān)的基因多態(tài)性。首先基于已發(fā)表的膿毒癥遺傳關(guān)聯(lián)研究，從循證醫(yī)學(xué)角度進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)和meta分析，全面、充分理解膿毒癥發(fā)生的遺傳背景；其次采用候選基因策略選擇一些重要的免疫炎癥調(diào)控基因在臨床多中心創(chuàng)傷人群中繼續(xù)探索新的膿毒癥高�；蚨鄳B(tài)性位點(diǎn)及其生物學(xué)功能，為探索創(chuàng)傷膿毒癥預(yù)警診斷方法提供依據(jù)。 材料與方法 1.采用(sepsis OR "septic shock" OR septicemia) AND (polymorphism OR variationOR mutation)關(guān)鍵詞在Pubmed、Medline、Embase、Web of Science和HuGE等醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索和篩選基因多態(tài)性與膿毒癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的遺傳關(guān)聯(lián)研究相關(guān)文獻(xiàn)，針對(duì)≥2個(gè)研究人群的基因多態(tài)性位點(diǎn)在顯性模式、隱性模式和等位基因模式下采用meta分析方法評(píng)估與膿毒癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，并根據(jù)人群種族進(jìn)行分層分析。最后采用異質(zhì)性分析、敏感性分析、發(fā)表偏倚檢驗(yàn)和威尼斯等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)關(guān)聯(lián)結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。 2.從HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)下載NLRP3、SOCSs和microRNAs全基因及其延伸范圍內(nèi)的SNP在中國(guó)北京漢族人群中的基因型數(shù)據(jù)，采用TAGster軟件計(jì)算連鎖不平衡r2值（r2≥0.8）和構(gòu)建單倍型bin圖譜，從每一個(gè)bin內(nèi)挑選一個(gè)能夠代表整個(gè)bin內(nèi)SNP信息的標(biāo)簽SNP。此外，通過(guò)miRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象和靶基因預(yù)測(cè)分析挑選具有潛在功能性的pre-miRNASNP。 3.在連續(xù)收集的1408例(重慶地區(qū)806例、云南地區(qū)286例、浙江地區(qū)316例)中國(guó)漢族嚴(yán)重創(chuàng)傷患者中采用焦磷酸測(cè)序法進(jìn)行SNP位點(diǎn)的基因型檢測(cè)。計(jì)數(shù)各SNP的基因型分布，采用卡方檢驗(yàn)計(jì)算哈溫平衡、顯/隱性遺傳模式下各基因型與膿毒癥發(fā)生率之間的關(guān)系，單因素方差分析各基因型與MOD評(píng)分的關(guān)系，logistic回歸和線性回歸分別分析SNP與創(chuàng)傷后膿毒癥或MOD評(píng)分之間的等位基因劑量效應(yīng)，并進(jìn)行年齡、性別及ISS等混雜因素的校正。 4.采集創(chuàng)傷后2小時(shí)內(nèi)和健康自愿者外周血，在37℃條件下LPS（100ng/ml）孵育4小時(shí)，分離血漿和白細(xì)胞。采用ELISA檢測(cè)創(chuàng)傷患者血漿中細(xì)胞因子的表達(dá)水平，采用Real-time PCR檢測(cè)LPS刺激的健康自愿者外周血細(xì)胞中CIS表達(dá)水平 5.通過(guò)構(gòu)建野生型和突變型含有rs2027432-1017G/A、rs414171-237A/T的NLRP3或CIS啟動(dòng)子的pGL3質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人類(lèi)模式細(xì)胞系，采用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)觀察rs2027432-1017G/A、rs414171-237A/T分別對(duì)靶基因NLRP3、CIS啟動(dòng)子活性影響。相似的，通過(guò)構(gòu)建野生型和突變型的miR-608表達(dá)載體、轉(zhuǎn)染細(xì)胞和TaqMan探針?lè)ㄓ^察rs4919510G/C對(duì)成熟miR-608的表達(dá)影響。 結(jié)果 1.按照預(yù)定的納入標(biāo)準(zhǔn)從8796篇文獻(xiàn)中篩選出232篇膿毒癥遺傳關(guān)聯(lián)研究。對(duì)56個(gè)基因123個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的meta分析發(fā)現(xiàn)17個(gè)基因21個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)在不同的遺傳模式下與膿毒癥發(fā)生率密切相關(guān)，其中強(qiáng)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)5個(gè)，分別是NOD2rs2066844C/T、LBP rs2232618T/C、TNFA rs361525G/A、IL-10rs1800894、SETPDrs12219080；中等關(guān)聯(lián)強(qiáng)度位點(diǎn)6個(gè)，分別是TLR1rs5743611G/C、RAGE rs1800625T/C、MD2rs11465996C/G、IL-12B rs2195940、PBEF rs61330082T/C、SFTPD rs1998374。根據(jù)流行病學(xué)累計(jì)證據(jù)等級(jí)劃分沒(méi)有基因多態(tài)性位點(diǎn)的證據(jù)等級(jí)達(dá)到強(qiáng)度，5個(gè)位點(diǎn)為中等，，其余位點(diǎn)為微弱等級(jí)。通過(guò)亞組分析額外發(fā)現(xiàn)IL-10rs1800896在亞洲人群中與膿毒癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈較弱關(guān)聯(lián)性，流行病學(xué)累計(jì)證據(jù)等級(jí)為微弱等級(jí)。此外，對(duì)僅有一組研究數(shù)據(jù)的94個(gè)基因177個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)31個(gè)基因的42個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與膿毒癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，這些關(guān)聯(lián)性需要更大研究人群和檢驗(yàn)功效的研究去證實(shí)。 2.基于中國(guó)北京漢族人群中的SNP基因型數(shù)據(jù)，通過(guò)構(gòu)建單倍型bin圖譜從35個(gè)NLRP3SNPs中挑選6個(gè)標(biāo)簽SNP；采用相同的方法根據(jù)連鎖不平衡強(qiáng)度（r2值）從7個(gè)SOCS基因145個(gè)SNPs中挑選12個(gè)標(biāo)簽SNP。此外，通過(guò)miRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和靶基因預(yù)測(cè)分析從26個(gè)pre-miRNA SNPs中挑選9個(gè)潛在功能性的SNP�？傆�(jì)在NLRP3、SOCSs和pre-miRNA基因范圍內(nèi)挑選出27個(gè)具有代表性和潛在功能性的SNP。 3.在6個(gè)NLRP3標(biāo)簽SNP中，在重慶創(chuàng)傷人群中兩個(gè)SNP（srs2027432-1017G/A、rs12048215+5134A/G)與創(chuàng)傷膿毒癥和MODS的發(fā)生密切相關(guān)，顯示A等位基因攜帶者創(chuàng)傷后發(fā)生膿毒癥和MODS的機(jī)率明顯增高，LPS誘導(dǎo)的血漿IL-1β表達(dá)升高；但兩個(gè)SNP并無(wú)協(xié)同效應(yīng)。此外，通過(guò)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)也證實(shí)-1017A等位基因顯著增強(qiáng)NLRP3啟動(dòng)子活性。 4.在12個(gè)SOCS標(biāo)簽SNP中，在重慶和浙江創(chuàng)傷人群中CIS基因的rs414171-237A→T和SOCS7rs3748726+49083T→C單獨(dú)和協(xié)同地降低創(chuàng)傷后膿毒癥和MODS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，其中CIS-237T能夠降低血漿促炎細(xì)胞因子TNF-α和增加抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)水平，同時(shí)降低LPS誘導(dǎo)的外周血白細(xì)胞CIS表達(dá)；熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)也證實(shí)-237T減弱CIS啟動(dòng)活性。 5.在9個(gè)篩選出的潛在功能性miRNA SNPs中。僅有miR-608rs4919510C等位基因在重慶、云南和浙江三個(gè)創(chuàng)傷人群中明顯增加創(chuàng)傷后膿毒癥和MODS的發(fā)生，且將三個(gè)人群合并后的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度更大�；蛐�-表型分析發(fā)現(xiàn)rs4919510C顯著降低抗炎細(xì)胞因子和增加促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)G→C增強(qiáng)成熟miR-608表達(dá)水平。 結(jié)論 本課題首次針對(duì)已發(fā)表的膿毒癥易患性遺傳關(guān)聯(lián)研究進(jìn)行較為系統(tǒng)、全面的meta分析闡明膿毒癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的高�；蚨鄳B(tài)性位點(diǎn)。同時(shí)通過(guò)臨床多中心創(chuàng)傷患者的遺傳關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)NLRP3rs2027432、rs12048215，CIS rs414171，SOCS7rs3748726和miR-608rs4919510等5個(gè)新的與創(chuàng)傷后膿毒癥或MODS發(fā)生密切相關(guān)的基因多態(tài)性位點(diǎn)。為探尋創(chuàng)傷膿毒癥的分子遺傳學(xué)診斷方法，以及開(kāi)展創(chuàng)傷個(gè)體化治療提供了系列有重要臨床價(jià)值的遺傳標(biāo)志物
[Abstract]:Background of the study

Trauma is a public health problem which is seriously harmful to human health . It is the main cause of death of people under 45 years of age . The complications such as sepsis and multiple organ dysfunction syndrome ( MODS ) are the key to the death of patients . Therefore , it is suggested that early prevention and targeted therapy are the key to improve the prognosis of patients with severe trauma .

The purpose of this study was to explore and detect genetic polymorphisms associated with susceptibility to trauma sepsis . First , based on published sepsis genetic association studies , systematic evaluation and meta - analysis were conducted from evidence - based medical perspectives to fully understand the genetic background of sepsis .
Secondly , we use the candidate gene strategy to select some important immune inflammatory regulatory genes to continue to explore new sepsis high - risk gene polymorphism sites and their biological functions in the clinical multi - center wound population , and provide the basis for the exploration of early warning diagnostic methods for wound sepsis .

Materials and Methods

1 . To search and screen genetic association between genetic polymorphism and risk of sepsis in medical literature database such as Pubmed , Medline , Embase , Web of Science and HuGE by using ( sepsis OR " septic shock " OR polymorphism ) and ( polymorphism OR variationOR mutation ) keyword .

2 . The genotype data of NLRP3 , SOCSs and microRNAs in Beijing Han population were downloaded from HapMap database . Using TAGster software to calculate linkage disequilibrium r2 ( r2 鈮

本文編號(hào)：1916766