本文選題：急性心肌梗死模型　切入點：小型豬　出處：《鄭州大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction, AMI)是在冠狀動脈病變的基礎(chǔ)上,由冠狀動脈內(nèi)粥樣硬化斑塊的突然破裂,繼而出血和管腔內(nèi)血栓形成,致冠狀動脈血供急劇減少或突然中斷,使相應(yīng)區(qū)域的心肌嚴(yán)重而持久地急性缺血、缺氧進而導(dǎo)致心肌壞死的臨床綜合征。 目前,急性心肌梗死的治療方法包括藥物治療(冠脈溶栓等)、介入治療(球囊擴張或支架)以及冠狀動脈旁路移植術(shù)等。雖然近年來不斷涌現(xiàn)的新型治療方式和工業(yè)化設(shè)備對改善急性心肌梗死的預(yù)后起到了積極的作用,但急性心肌梗死仍嚴(yán)重威脅著人類的生命,臨床上必須高度重視,緊急處理并進一步尋求最佳治療方法。 眾所周知,心肌梗死的修復(fù)過程與血管的結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)密切相關(guān),梗死區(qū)內(nèi)是否有血管迅速生成或殘留的血管是否重新開放,對于心肌梗死后建立良好的側(cè)支循環(huán)來改善梗死區(qū)血液供應(yīng)及梗死區(qū)心肌的存活具有非常重要的意義。血管生成是一個多步驟、且受到嚴(yán)密調(diào)控的復(fù)雜過程,這些調(diào)控主要是通過多種因子在時間和空間上協(xié)同作用,共同促進血管生成。近年來,隨著對AMI梗死區(qū)血管新生和血管生長因子研究的不斷深入,通過調(diào)控梗死區(qū)多種血管生成相關(guān)因子的表達(dá)來刺激缺血區(qū)小血管生長,促進側(cè)支循環(huán)的建立便成了AMI治療的十分誘人且直觀合理的方法。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSC)是一種多能成體干細(xì)胞,具有多向分化的潛能,可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。BMSC具有很強大的旁分泌能力,它們在心肌微環(huán)境中能通過自分泌或旁分泌VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)等多種促血管新生的細(xì)胞因子,刺激局部血管和心肌細(xì)胞的增生,抑制缺血區(qū)心肌細(xì)胞凋亡。 微小RNA(microRNA, miRNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一種長度為18-26核苷酸的單鏈內(nèi)源性非編碼小RNA,其序列高度保守,通過與靶基因序列特異性相互作用在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達(dá),與其目標(biāo)mRNA分子的3’端非編碼區(qū)(3'-Untranslated Regions,3'-UTR)互補匹配發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用,參與多種生物學(xué)過程。近年來有學(xué)者認(rèn)為miRNA可以作為干細(xì)胞移植治療AMI的一個新的切入點。而miRNA-126(miR-126)是目前報道的與血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管功能密切相關(guān)的miRNA,主要在心、肺組織中高度表達(dá),其缺失可延遲血管芽生,致血管完整性破壞。 我們推測miR-126通過對BMSC的調(diào)節(jié)來調(diào)控梗死區(qū)多種血管生成相關(guān)因子的表達(dá),刺激缺血區(qū)血管生長,促進側(cè)支循環(huán)的形成。為此,我們擬將穩(wěn)定過表達(dá)miR-126的BMSC應(yīng)用于小型豬急性心梗模型,并對其應(yīng)用效果及作用機制進行評估和探討,以期望為AMI治療探索一條新途徑。 第一部分慢病毒介導(dǎo)的miR-126穩(wěn)定過表達(dá)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的建立目的 建立BMSC的分離、培養(yǎng)方法,研究其在體外生長增殖的生物學(xué)特性及表型特征；構(gòu)建pCDH-miR-126慢病毒表達(dá)載體,建立穩(wěn)定過表達(dá)miR-126的miR-126-BMSC。方法 應(yīng)用Percoll細(xì)胞分離液,采用密度梯度離心法分離豬骨髓間質(zhì)干細(xì)胞,并進行培養(yǎng)和傳代。應(yīng)用MTT方法測定培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線,應(yīng)用流式細(xì)胞儀鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。構(gòu)建慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pCDH-miR-126,用HEK293T細(xì)胞包裝后產(chǎn)生的成熟慢病毒顆粒感染BMSC細(xì)胞,建立穩(wěn)定過表達(dá)miR-126的BMSC。最后用qPCR檢測miR-126的表達(dá)水平。 結(jié)果 原代培養(yǎng)的BMSC24h內(nèi)貼壁并伸展成多角形、梭形,前3天為相對抑制期,其后細(xì)胞增殖速度逐漸加快,呈對數(shù)形式,7天左右至平臺期,細(xì)胞覆蓋率達(dá)95%左右,傳至第3代時可到106個數(shù)量級細(xì)胞,能夠滿足細(xì)胞移植數(shù)量的需要,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測BMSC的標(biāo)志,顯示CD44陽性,而CD34陰性,符合BMSC特征。 PCR和酶切電泳驗證pCDH-miR-126重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；經(jīng)HEK293T細(xì)胞病毒包裝,感染BMSC細(xì)胞后,miR-126-BMSC表達(dá)miR-126水平明顯升高。 結(jié)論 利用Percoll細(xì)胞分離液,采用梯度密度離心法成功分離出較為均一的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞；體外培養(yǎng)生長穩(wěn)定,傳代后細(xì)胞生長較快。 成功構(gòu)建pCDH-miR-126慢病毒重組質(zhì)粒,建立了穩(wěn)定表達(dá)miR-126的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞株miR-126-BMSC,為研究miR-126對豬心肌梗死血管生成的影響及機制提供了有用的細(xì)胞模型。第二部分小型豬急性心肌梗死模型的建立及評價目的 結(jié)扎小型豬冠狀動脈左前降支(Left Anterior Desending Branch,LAD)建立急性心肌梗死模型,并評價其效果。方法 選取實驗用小豬12只,常規(guī)全身麻醉,氣管插管,平臥于導(dǎo)管室手術(shù)臺,四肢妥善固定,并同時給予實時心電監(jiān)護、血壓監(jiān)測,置入經(jīng)食管超聲探頭,連接心臟超聲儀。全身肝素化,經(jīng)股動脈穿刺并留置鞘管,先行冠狀動脈造影(Coronary Artery Angiography,CAG)證實其左前降支及其他冠狀動脈通暢,無狹窄或閉塞等病變。左前胸局部備皮,開胸,打開心包,顯露冠狀動脈左前降支,在第一對角支遠(yuǎn)端約1.5-2cm處以縫線結(jié)扎左前降支,構(gòu)建急性心肌梗死模型。心電監(jiān)護及描圖提示多個導(dǎo)聯(lián)ST段明顯弓背向上抬高,結(jié)扎部位以遠(yuǎn)左室前壁及心尖部顏色變暗、變紫、變白,心尖部室壁運動明顯減弱或消失,冠狀動脈造影顯示左前降支完全梗阻,證明造模成功。止血,關(guān)胸。待豬自主呼吸恢復(fù)后拔除氣管插管。檢測術(shù)前及術(shù)后24h心肌損傷標(biāo)志物CK、CK-MB、 cTnI等。術(shù)后2d開始進食,術(shù)后3d內(nèi)給予抗生素。術(shù)后第2周,復(fù)查經(jīng)食管超聲心動圖、冠狀動脈造影及心肌核素灌注顯像(Emssion Computed Tomography, ECT)檢查；術(shù)后第6周(實驗結(jié)束后),全麻后靜脈注射氯化鉀,處死動物,剖出心臟,取出左前降支供應(yīng)區(qū)域的缺血區(qū)及正常區(qū)左心室心肌,行相關(guān)病理學(xué)檢查。 結(jié)果 12頭小型豬中有9頭存活,成活率75%。冠狀動脈左前降支完全結(jié)扎、血流阻斷后,可見心電圖ST段下斜形或弓背狀抬高,持續(xù)0.5h,為急性心肌梗死心電圖表現(xiàn)。前降支結(jié)扎2411后血清心肌酶譜(CK, CK-MB、cTnI)較術(shù)前顯著增高2倍以上,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；經(jīng)食管超聲心動圖檢查結(jié)示造模后與造模前比較實驗動物心功能明顯降低：EF、FS顯著降低,LVESD、LVEDD. LVEDV等顯著增大,有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)；冠狀動脈造影顯示造模后左前降支血流完全中斷,TIMI血流分級為0級；ECT示前降支遠(yuǎn)段支配區(qū)域較術(shù)前明顯灌注缺損；證實心梗模型建立成功。術(shù)后病理檢查結(jié)果顯示梗死區(qū)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂、排列不齊,肌細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞核大小不甚規(guī)則,細(xì)胞分界不清楚。 結(jié)論 利用冠狀動脈結(jié)扎法制備小型豬急性心肌梗死模型,心電監(jiān)護顯示ST段弓背向上抬高持續(xù)0.5h;心肌酶學(xué)CK、CK-MB和cTnI均增高2倍以上；超聲心動圖顯示心功能顯著減低；冠狀動脈造影顯示左前降支中遠(yuǎn)段結(jié)扎部位處完全閉塞；心肌ECT示前降支中遠(yuǎn)段供應(yīng)區(qū)域明顯灌注缺損。成功建立了小型豬急性心肌梗死模型。 第三部分miR-126-BMSC對小型豬急性心肌梗死區(qū)血管生成的影響 目的 將miR-126-BMSC注射到小型豬心肌梗死區(qū)域,4周后通過對超聲心動圖、冠狀動脈造影、心肌核素灌注顯像、梗死區(qū)域新生血管密度及血管內(nèi)皮生長因子等相關(guān)指標(biāo)及參數(shù)的觀察,探討miR-126-BMSC對小型豬急性心肌梗死區(qū)血管新生的影響與機制。 方法 制模2周后,將實驗動物隨機分為3組：組I.模型組(n=3)：即對照組,對梗死區(qū)心肌組織內(nèi)注射PBS；組Ⅱ.BMSC組(n=3)：對梗死區(qū)心肌組織內(nèi)注射BMSC;組Ⅲ. miR-126組(n=3)：對梗死區(qū)心肌組織內(nèi)注射miR-126-BMSC.移植(注射)后4周復(fù)查經(jīng)食管超聲心動圖、冠脈造影及心肌核素灌注顯影,開胸取出心臟進行心臟病理改變檢測,留取標(biāo)本熒光顯微鏡下觀察GFP蛋白的表達(dá)；免疫組化檢測VIII因子特異性內(nèi)皮標(biāo)記,同時利用RT-PCR及免疫印跡測定各組中VEGF mRNA及蛋白含量。 結(jié)果 移植4周后,經(jīng)食管超聲心動圖示BMSC組及miR-126組心功能均較移植前有明顯改善,且均與模型組存在統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05),其中miR-126組EF、 FS改善程度及LVEDD、LVESD減小程度要明顯高于單純BMSC移植組p0.05)；冠脈造影示miR-126組梗死區(qū)有相對明顯的細(xì)小側(cè)枝形成,BMSC組及miR-126組TIMI評級高于模型組,且miR-126組高于BMSC組,存在統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)；心肌ECT提示BMSC組及miR-126組缺損面積百分比均低于模型組,且miR-126組明顯低于BMSC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)；熒光顯微鏡檢查顯示,BMSC組和miR-126組小型豬心肌梗死區(qū)組織切片可見綠色熒光,模型組無任何熒光,細(xì)胞計數(shù)示miR-126組明顯高于BMSC組(p＜0.05)；Ⅷ因子染色可見BMSC組和miR-126組缺血肌肉組織的血管新生均明顯增強,以miR-126組的血管密度最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。RT-PCR及免疫印跡結(jié)果顯示BMSC組和miR-126組梗死區(qū)組織中VEGF mRNA及蛋白顯著高于對照組,以miR-126組表達(dá)最高(p＜0.05)。 結(jié)論 將miR-126-BMSC注射入小型豬心肌梗死區(qū),可明顯增加該區(qū)域新生血管數(shù)量,促進梗死區(qū)血管新生,利于冠狀動脈側(cè)支循環(huán)的建立,增加心肌血流量,改善心臟功能。miR-126-BMSC促進新生血管形成可能與miR-126過表達(dá)引起的VEGF mRNA及其蛋白的表達(dá)增加密切相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R542.22

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1720372