本文選題：顱腦外傷　切入點：ω-3　出處：《復旦大學》2014年博士論文

【摘要】：創(chuàng)傷性腦損傷(traumaitc brain injury, TBI),簡稱顱腦外傷,是神經外科領域常見的急癥之一,目前已成為全世界35歲以下青壯年人群死亡和致殘的第一位原因(http://www.dc.gov/traumaticbraininjury/statistics.html#3)。隨著我國國民經濟和交通運輸業(yè)等發(fā)展,我國顱腦外傷病例也呈上升趨勢,其中百分之七八十是由交通事故造成,另一個主要原因是工傷意外。目前醫(yī)學界對顱腦外傷的整體研究尚不深入,也不夠完善,顱腦外傷的基礎研究和臨床防治應用研究還很薄弱。目前臨床上尚無一種確切的藥物對腦損傷肯定有效。本論文分別觀測了食物補充OMEGA-3(co-3)多不飽和脂肪酸以及NKCC1抑制對小鼠顱腦外傷的神經保護作用。一. 食物補充 ω-3多不飽和脂肪酸(omega-3 polyunsaturated fatty acid,ω-3 PUFAs)對小鼠顱腦外傷的神經保護作用。ω-3 PUFAs作為一類重要的不飽和脂肪酸,在腦內含量極為豐富,主要分布于神經元細胞膜特別是神經突觸前膜上,并且對于維持腦的解剖結構,生化和生理功能的完整性具有極為重要的作用。以往的研究結果顯示,作為ω-3 PUFA s在成年小鼠創(chuàng)傷性腦損傷中具有顯著的神經保護作用,其作用機制涉及抗凋亡,抗炎癥,抑制氧化應激反應,促進神經營養(yǎng)因子分泌,減輕神經興奮毒性,促進神經細胞再生等；后來,James D等人提出ω-3 PUFAs對顱腦外傷后白質損傷極有可能具有保護作用[1]。因此,我們的研究主要目的是：證實ω-3 PUFAs在創(chuàng)傷性腦損傷中的作用,并深入探究ω-3 PUFAs的白質損傷修復的保護機制。我們將實驗小鼠隨機分為假手術組(sham),對照組(CCI),干預組(ω-3 CCI)。采用肌力測試、前肢不對稱測試以及錯步實驗來評測短期和長期運動功能,利用水迷宮測試高級認知功能(學習,記憶能力)。焦油紫染色用來分析計算損傷體積和計算海馬CA3區(qū)存活神經元數量。Ibal/CD86/CD206免疫組織化學染色來觀察顱腦外傷后小膠質細胞的激活情況以及M1期,M2期小膠質細胞的分布情況。MBP/SMI32免疫組織化學染色、western blot、電鏡觀察TBI后損傷周邊區(qū)胼胝體超微結構、電生理檢測TBI后損傷周邊區(qū)胼胝體的動作電位傳導能力等方法來分析顱腦外傷后白質損傷修復情況。同時為了探討神經保護機制,我們進行體外實驗來研究具體的作用機制。研究結果顯示：ω-3 PUFAs雖然不能減少小鼠顱腦外傷后的組織缺失,但卻能明顯改善損傷后長期的小鼠神經行為學表現,提高學習、記憶能力。進一步研究發(fā)現,ω-3 PUFAs組顯著減少損傷后海馬CA3區(qū)神經元丟失、抑制損傷后的小膠質細胞的過度激活、減輕外傷后損傷周邊區(qū)的髓鞘脫失,尤其改善損傷周邊區(qū)胼胝體動作電位的傳導。體外實驗中,一方面,DHA預處理后的少突膠質細胞明顯減輕AMPA誘導的退行性變,提高了存活率；另一方面,DHA預處理后的小膠質細胞和少突膠質細胞共培養(yǎng)時,明顯減輕AM PA誘導的少突膠質細胞退行性變,提高了存活率。結果表明,ω-3 PUFAs家族中的主成員DHA可以通過直接和間接的方式來減輕AMPA對少突膠質細胞的損害�？傊�,本研究顯示,ω-3 PUFAs能明顯改善顱腦外傷造成的神經功能缺失,同時能明顯減輕海馬神經元變性壞死,增強學習記憶功能。本實驗為臨床運用co-3PUFAs防治顱腦外傷,促進神經功能恢復,提供了重要的實驗依據。二.NKCC1抑制(抑制劑Bumetanide或NKCC1敲除)對小鼠顱腦外傷的神經保護作用：鈉-鉀-氯共轉運體(Na+-K+-2Cl--cotransporter,NKCC)是一類分布廣泛的離子轉運載體,包括NKCC1和NKCC2兩種亞型。NKCC1是CNS內唯一的NKCC蛋白,表達在微血管內皮細胞、星形膠質細胞和神經元的胞體細胞膜和軸突上,是維持BBB選擇性離子通透性、保持星形膠質細胞和神經元細胞內正常離子濃度及細胞容積,發(fā)揮正常功能的結構基礎。NKCC2主要分布在腎臟髓袢升支粗段的上皮細胞,參與全身水和電解質的代謝[2]。目前研究發(fā)現,NKCC1主要表達在神經膠質細胞和神經元中,但是關于其在TBI中發(fā)揮腦保護作用的研究較少[3-5]。本實驗通過研究小鼠在TBI后,抑制NKCC1對小鼠腦含水量和神經功能改變的影響,以及可能通過保護血腦屏障和促進白質損傷修復而發(fā)揮腦保護作用的機制,為NKCC1抑制劑-布美他尼(bumetanide)可能成為潛在的腦保護劑提供實驗基礎和理論依據。我們隨機將野生型實驗小鼠分為假手術組(sham),對照組(vehicle),干預組(Bumetani de),同時我們采用NKCC1敲除小鼠進一步確認NKCC1在顱顱腦外傷中的作用,將基因敲除小鼠分為NKCC1+/+段手術組(NKCC1+/+ sham),NKCC1+/+假手術組(NKCC1+/-sham),NKCC1+/+手術組(NKCC1+/+CCI),NKCC1+/-手術組(NKCC1+/-CCI)。采用肌力測試、前肢不對稱測試以及錯步實驗來評測短期和長期感覺運動功能。焦油紫染色測定腦缺損體積。伊文斯藍注入測量其通過血腦屏障通透性并采用免疫組織化學和、western blot分析其緊密連接蛋白、分析腦水腫；同時用電鏡觀察各處理組的血腦屏障超微結構的破壞情況。MBP/SMI32免疫組織化學染色、western blot、電鏡觀察TBI周邊區(qū)胼胝體超微結構、電生理檢測TBI周邊區(qū)胼胝體的動作電位傳導能力等方法來分析顱腦外傷后白質損傷修復情況。研究結果顯示：Bumetani de雖然不能減少小鼠顱腦外傷后的組織缺失,但卻能明顯改善損傷后長期的小鼠神經行為學表現；抑制神經元和星形膠質細胞中MMP9的表達和活性,減輕其對血腦屏障緊密連接蛋白的降解,進而減輕損傷周邊區(qū)血腦屏障的破壞,保持血腦屏障正常的通透性；抑制外傷后損傷周邊區(qū)的髓鞘脫失和軸突損傷,促進髓鞘相關蛋白的合成,改善損傷周邊區(qū)胼胝體動作電位的傳導,促進白質損傷修復；上述保護作用在轉基因小鼠身上也得到驗證：相對于NKCC1+/+(野生型)小鼠,NKCC1+/-(NKCC1雜合子型)的小鼠在腦中風后感覺運動功能明顯好轉,IgG的滲出明顯減少,白質損傷修復明顯增強。總之,本研究顯示,NKCCl抑制能明顯改善顱腦外傷后的神經行為學表現,促進神經功能的恢復。本實驗為臨床運用Bumetanide防治顱腦外傷,促進神經功能恢復,提供了重要的實驗依據。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R651.15

【參考文獻】

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1 裴旭穎;倪康欣;周優(yōu);應琨;張翔南;厲旭云;陸源;陳忠;;肌肽對小鼠閉合性腦損傷的保護作用[J];浙江大學學報(醫(yī)學版);2013年03期

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本文編號：1686379