本文選題：種子細胞　切入點：凍存　出處：《浙江大學》2014年博士論文

【摘要】：背景 每年因肝臟疾病死亡的人數(shù)呈現(xiàn)持續(xù)增加趨勢。人工肝作為治療肝衰竭的有效手段成為近些年的研究熱點,其目標為幫助病患等待適宜的供體器官或自體肝再生。我國在非生物型人工肝支持系統(tǒng)領(lǐng)域已經(jīng)取得較大進步,但生物型人工肝系統(tǒng)的研究與國外發(fā)達國家相比尚有差距。 目的 本課題組擬選擇功能最佳的人源性永生化肝細胞制作微囊,以大規(guī)模于液氮中凍存后,在新型生物人工肝支持系統(tǒng)中檢測肝衰竭病人血漿對肝細胞的毒性作用以及肝細胞對肝衰竭病人血漿的清除效果,為生物型人工肝的臨床試驗奠定基礎。 方法 1.永生化人源肝細胞的功能評價。利用MTT、實時定量PCR、免疫熒光和Western blot及ELISA等檢測增殖及功能。 2.將反應器流化培養(yǎng)的永生化肝細胞系微囊與靜態(tài)培養(yǎng)肝細胞系微囊、二維培養(yǎng)肝細胞作對比,比較細胞中與功能相關(guān)Ⅰ相酶、Ⅱ相酶和特異性核受體基因、CYP450蛋白表達的變化。檢測肝細胞生存率及白蛋白分泌和尿素合成確定凍存條件、凍存時間以及復蘇孵育條件并且評價微囊化肝細胞大規(guī)模凍存效果。 3.體外初步評價生物人工肝的有效性。收集肝衰竭病人血漿,將復蘇并孵育后的肝細胞微囊加入到肝衰竭病人血漿中培養(yǎng)24h,觀察肝衰竭病人血漿對微囊內(nèi)肝細胞活性和功能的影響以及肝衰竭病人血漿內(nèi)重要物質(zhì)成分的變化。 結(jié)果 1HepLi3細胞增殖能力最好,可以進行大規(guī)模的培養(yǎng),獲得高數(shù)量的細胞,而且其在功能上明顯優(yōu)于其他永生化肝細胞。 2.微囊化和流化培養(yǎng)的肝細胞在培養(yǎng)過程中保持很好的活性；微囊化的培養(yǎng)方式可以促進肝細胞特異基因及蛋白的表達；此種培養(yǎng)方式可能是通過抑制細胞內(nèi)磷酸激酶活性來提高肝細胞特異性功能的。 3.確定微囊制作完成孵育2h后進行凍存操作；凍存復蘇后孵育2h,其功能可恢復很好,且將體積擴大到50毫升不會影響肝細胞的凍存后的功能。 4.肝衰竭病人血漿造成肝細胞活率下降12%,但不影響其作為種子細胞的應用。而且微囊化肝細胞系可以改變肝衰竭病人血漿中物質(zhì)成分,促進其體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,為其臨床應用奠定基礎。 結(jié)論 1.本實驗室制作的HepLi3可作為生物人工肝的種子細胞有效發(fā)揮肝特異性功能。 2.確定了微囊的制作,肝細胞凍存及復蘇的條件,并探究蛋白激酶的抑制可能是微囊化促進肝細胞功能的原因。 3.大規(guī)模凍存微囊化肝細胞后,細胞活性保持良好,可以為生物人工肝提供種子細胞庫。 4.利用肝衰竭病人血漿及生物反應器證明凍存后的微囊化肝細胞可降低重肝血漿中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和直接膽紅素。
[Abstract]:Background. The number of deaths due to liver diseases is increasing every year. Artificial liver, as an effective method to treat liver failure, has become a hot research topic in recent years. Our country has made great progress in the field of non-biological artificial liver support system, but the research of biological artificial liver system is still far from that of developed countries. Purpose. Our team intends to select the best functional human immortalized hepatocytes to make microcapsules for large-scale cryopreservation in liquid nitrogen. The toxicity of plasma to hepatocytes in patients with liver failure and the clearance effect of hepatocytes to plasma of patients with liver failure were detected in a new bioartificial liver support system, which laid a foundation for clinical trials of bioartificial liver. Method. 1. Function evaluation of immortalized human hepatocytes. Proliferation and function were detected by MTT, real-time quantitative PCR, immunofluorescence, Western blot and ELISA. 2. Immortalized liver cell line microcapsules were cultured in fluidized reactor and cultured in static state. The two dimensional culture of liver cells was compared to compare the phase I enzymes related to function in the cells. The changes of CYP450 protein expression in phase 鈪，

本文編號：1667467