本文選題：BML-111　切入點：膿毒血癥　出處：《華中科技大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：第一部分脂氧素受體激動劑BML-111在小鼠膿毒血癥所致急性肺損傷中的保護效應(yīng) 目的建立小鼠膿毒血癥模型,探討脂氧素受體激動劑BML-111對膿毒血癥所致急性肺損傷的保護作用。 方法SPF級雄性BALB/c小鼠,6-7周,體重25g左右,隨機分成5組：(1)空白組(Control組)：小鼠經(jīng)腹腔注射生理鹽水(5ml/kg體重),30mmin后再經(jīng)腹腔注射生理鹽水(5ml/kg體重)；(2)對照組(BML-111組)：小鼠經(jīng)腹腔注射BML-111(1mg/kg體重),30mmin后經(jīng)腹腔注射生理鹽水(5ml/kg體重)；(3)模型組(LPS組)：小鼠經(jīng)腹腔注射生理鹽水(5ml/kg體重),30min后經(jīng)腹腔注射LPS (10mg/kg體重)建立小鼠膿毒血癥；(4)干預(yù)組(BML-111+LPS組)：小鼠經(jīng)腹腔注射BML-111(1mg/kg體重),30min后經(jīng)腹腔注射LPS (10mg/kg體重)；(5)拮抗組(Boc-2組)：在小鼠給予BML-111和LPS前15min,經(jīng)腹腔注射Boc-2(50μg/kg體重)。記錄5組小鼠的生存情況和體重變化情況。在模型建立24h后,頸動脈放血處死。光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺組織HE染色病理切片并進行肺損傷評分；測定支氣管肺泡灌洗(BALF)中性粒細胞數(shù)；ELISA法檢測肺組織和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白介素-6(IL-6)的濃度。結(jié)果與空白組比較,膿毒血癥模型組小鼠死亡率明顯上升,建模后24h體重顯著下降(p0.01),膿毒血癥模型組小鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變,肺損傷評分明顯升高(p0.01),支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的中性粒細胞計數(shù)顯著提高(P0.01),肺組織和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α和IL-6濃度顯著升高(P0.01)。與膿毒血癥模型組小鼠相比,干預(yù)組小鼠的存活率明顯提高,建模后24h的體重改變程度明顯減輕(p0.01)；BML-111可以顯著減少BALF中中性粒細胞數(shù)(P0.01),抑制肺組織和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α和IL-6的產(chǎn)生(P0.01)。脂氧素受體阻斷劑Boo-2可阻斷BML-111對炎癥反應(yīng)的抑制作用(P0.01)。 結(jié)論BML-111可以改善小鼠膿毒血癥的癥狀,減輕膿毒血癥所致急性肺損傷的病變程度,減少中性粒細胞的浸潤,減少肺組織炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和滲出,BML-111對膿毒血癥所致急性肺損傷具有一定的保護作用。 第二部分脂氧素受體激動劑BML-111對小鼠膿毒血癥中肺血管內(nèi)皮通透性改變的影響 目的探討脂氧素受體激動劑BML-111對膿毒血癥中肺血管內(nèi)皮通透性改變的影響以及對血管內(nèi)皮連接蛋白ZO-1和VE-Cadherin表達的影響。 方法SPF級雄性BALB/c小鼠,6-7周,體重25g左右,隨機分成5組：(1)空白組(Control組)：小鼠經(jīng)腹腔注射生理鹽水(5ml/kg體重),30min后再經(jīng)腹腔注射生理鹽水(5ml/kg體重)；(2)對照組(BML-111組)：小鼠經(jīng)腹腔注射BML-111(1mg/kg體重),30min后經(jīng)腹腔注射生理鹽水(5ml/kg體重)；(3)模型組(LPS組)：小鼠經(jīng)腹腔注射生理鹽水(5ml/kg體重),30min后經(jīng)腹腔注射LPS (10mg/kg體重)建立小鼠膿毒血癥；(4)干預(yù)組(BML-111+LPS組)：小鼠經(jīng)腹腔注射BML-111(lmg/kg體重),30min后經(jīng)腹腔注射LPS (10mg/kg體重)；(5)拮抗組(Boc-2組)：在小鼠給予BML-111和LPS前15min,經(jīng)腹腔注射Boc-2(5Oμg/kg體重)。5組小鼠在模型建立后24h,頸動脈放血處死。測定小鼠肺組織濕/干重比(wet/dry weight ratio, W/D);檢測支氣管肺泡灌洗液中(BALF)的總蛋白濃度；Evans Blue法檢測肺血管滲透性改變；Western Blot法檢測肺組織血管內(nèi)皮連接蛋白ZO-1及VE-Cadherin的蛋白表達水平。 結(jié)果與空白組相比,膿毒血癥模型組小鼠肺組織滲出增加(W/D比)p0.01),血管內(nèi)皮通透性增高(Evans Blue吸光度)p0.01),支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白濃度顯著提高(P0.01),肺組織血管內(nèi)皮連接蛋白ZO-1及VE-Cadherin的蛋白表達水平降低(P0.05)。與膿毒血癥模型相比,脂氧素受體激動劑BML-111可顯著減少肺組織的滲出(W/D比)(P0.01),減輕肺組織微血管Evans Blue的滲透(P0.01),顯著降低支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白濃度(P0.01),上調(diào)肺組織中ZO-1及VE-Cadherin的蛋白表達水平(P0.05)。脂氧素受體阻斷劑Boc-2能顯著阻斷脂氧素受體激動劑BML-111對肺血管內(nèi)皮通透性改變的保護作用。 結(jié)論BML-111可明顯降低肺血管內(nèi)皮通透性增加所引起的肺水腫和大分子物質(zhì)滲出。BML-111可能是通過上調(diào)血管內(nèi)皮黏附連接蛋白VE-Cadherin和緊密連接蛋白ZO-1的表達這一分子機制來實現(xiàn)其對維持肺血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整和肺泡-毛細胞血管屏障功能的保護作用。 第三部分脂氧素受體激動劑BML-111對脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞連接蛋白表達的影響 目的研究脂氧素受體激動劑BML-111對脂多糖誘導(dǎo)人內(nèi)皮細胞(EA.hy926)血管內(nèi)皮連接蛋白ZO-1和VE-Cadherin表達的影響。 方法以1μg/ml濃度的LPS刺激體外培養(yǎng)人內(nèi)皮細胞株EA.hy926,根據(jù)藥物不同將細胞分成5組(1)空白組(Control組)：用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基處理；(2)對照組(BML-111組)：用含200nM BML-111的無血清DMEM高糖培養(yǎng)基處理；(3)模型組(LPS組)：用含1μg/ml LPS的無血清DMEM高糖培養(yǎng)基處理；(4)干預(yù)組(BML-111+LPS組)：用含不同濃度BML-111(50nM、200nM)的無血清培養(yǎng)基處理30min后加終濃度為1μ/gml的LPS處理；(5)拮抗組(Boc-2組)：在給予200nMBML-111和LPS處理前,加入100μMBoc-2處理15min。采用Western blot法檢測內(nèi)皮細胞連接蛋白ZO-1和VE-Cadherin表達以及內(nèi)皮細胞MAPKs蛋白和Akt蛋白磷酸化作用。采用免疫熒光法檢測內(nèi)皮細胞上連接蛋白ZO-1和VE-Cadherin的分布表達。 結(jié)果Western blot和免疫熒光結(jié)果均表示,1μg/m;LPS刺激內(nèi)皮細胞可抑制ZO-1和VE-Cadherin的表達(P0.05)。200nM BML-111預(yù)處理可上調(diào)ZO-1和VE-Cadherin的表達(P0.05),使內(nèi)皮細胞恢復(fù)正常排列。200nMBML-111可抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞Akt、ERK1/2、p38-MAPK的磷酸化。 結(jié)論BML-111通過上調(diào)內(nèi)皮細胞連接蛋白ZO-1和VE-Cadherin的表達和抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞Akt、ERK1/2、p38-MAPK的磷酸化,發(fā)揮其穩(wěn)定內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)、維持其正常功能的抗炎和促炎癥消退作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R459.7

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