本文關鍵詞： 腦出血 血管性血友病因子 ADAMTS13 中性粒細胞 小膠質(zhì)細胞 組織纖溶酶原激活劑激活劑　出處：《復旦大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景：腦中風又稱為腦卒中,是世界三大致死性和致殘性疾病之一。腦中風分為缺血性腦中風和出血性腦中風,其中缺血性腦中風約占所有腦中風的80%,出血性腦中風主要分為蛛網(wǎng)膜下腔出血和腦出血,腦出血約占所有腦中風的15%,盡管腦出血在所有腦中風中所占比例不高,但是腦出血在所有腦中風疾病中的死亡率居首位。tPA是目前唯一被美國國家食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準用于急性缺血性腦中風的藥物,但是tPA治療后易引起溶栓性腦出血。tPA引起的溶栓性腦出血機制尚未被闡明,但是有文獻報道tPA通過破壞血腦屏障引起腦出血。血管性血友病因子(von Willebrand factor vWF)是一種結(jié)構復雜的糖蛋白,在凝血和血栓中起重要作用,另外在炎癥反應系統(tǒng)中VWF作為炎癥介質(zhì)能夠通過促進炎癥細胞的粘附、聚集進而促進炎癥反應。有文獻報道VWF基因敲除能夠減少腦缺血后腦梗死體積。另外基礎和臨床研究表明蛛網(wǎng)膜下腔出血后血液中的vWF表達明顯上調(diào),vEF參與介導蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦梗死和血管痙攣的發(fā)生,vWF高表達會導致腦出血病人預后不良。ADAMTS13是vWF切割酶,vWF是目前已知ADAMTS13的唯一底物,ADAMTS13通過切割超聚化、功能超強的vWF使之成為分子量較小、活性較低的多肽,減少血栓形成和炎癥反應,減少腦缺血和蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)功能損傷。本實驗采用MCAO和ICH兩種腦中風模型,檢測這兩種動物模型對血漿vWF表達量的影響,并進一步探討vWF切割酶rADAMTS13對tPA引起的急性腦中風后溶栓性腦出血和腦出血后腦損傷和腦水腫的影響。實驗方法：課題整體分成兩個部分,第一部分：重組ADAMTS13對腦出血后腦損傷和腦水腫的作用機制研究；第二部分：重組ADAMTS13通過vWF減少腦缺血后tPA引起的腦出血。第一部分實驗方法：1.本實驗采用二次注血法在小鼠紋狀體中注入30μL自體血構建小鼠腦出血模型。2.用ELISA方法測定腦出血24h后血液中vWF水平變化情況。3.用HE染色法測定腦出血72h后腦損傷體積。4用干濕重法測定腦出血72h后腦組織含水量。5.用fluoro-jade B染色法檢測出血24h后血腫周邊神經(jīng)元變性情況。6.注射Evans blue觀察腦出血24h后血腦屏障通透。7.用ELISA檢測腦出血24h后IL-6表達情況。8.用MPO活性測定法測定MPO活性9.用免疫熒光技術測定腦出血24h后中性粒細胞浸潤、小膠質(zhì)細胞激活情況。10.用Western Blot測定腦出血24h后ICAM-1, VCAM-1表達情況。11.用明膠酶譜法測定腦出血后24h后MMP-9的活性。第二部分實驗方法： 1.本實驗采用小鼠單側(cè)大腦中動脈阻塞的方法(MCAO)建立局灶性缺血/再灌注模型。2.首先我們使用ELISA法檢測缺血造模后給予tPA導致的小鼠血漿vWF水平變化情況。3.用紫外分光光度計測定不同處理組(vehicle、tPA、vWF、tPA+vWF、tPA+rATS、tPA+vWF+rATS)的腦出血量。4.采用明膠酶譜法分析不同處理組(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA) MMP-9活性變化情況.5.應用Western Blot方法檢測不同處理組(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA)細胞核內(nèi)NF-κB表達情況6.用Western Blot方法測定不同處理組(sham、vehicle、 tPA、rATS+tPA) VEGF表達水平,利用免疫熒光法測定不同處理組(vehicle、 tPA、rATS+tPA) VEGF與CD31+的共標數(shù)量。7.利用Western Blot技術測定不同處理組(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA) RhoA激活的水平,通過免疫熒光計數(shù)不同組(vehicle、tPA、rATS+tPA) RhoA-GFAP共標細胞的數(shù)量。實驗結(jié)果：第一部分實驗結(jié)果：1.腦出血24h后血漿中的vWF水平比Sham組有明顯升高。2.重組ADAMTS13減少腦出血后腦損傷、腦水腫和神經(jīng)元變性。3.重組ADAMTS13減少腦出血后血腦屏障破壞。4.重組ADAMTS13能夠降低腦出血后IL-6表達水平。5.重組ADAMTS13能夠抑制腦出血后MPO活性上調(diào)。6.重組ADAMTS13減少腦出血周邊區(qū)域中性粒細胞浸潤和小膠質(zhì)細胞激活。7.重組ADAMTS13減少炎癥細胞間粘結(jié)蛋白ICAM-1的表達。8.重組ADAMTS13可以減少腦出血后腦組織中的MMP-9活性。第二部分實驗結(jié)果：1.小鼠缺血后給予tPA會導致血漿vWF水平上調(diào)。2.缺血造模后單獨給予vWF都會導致出血量增多,tPA共同給藥并沒有比單獨給予tPA或者vWF導致更多出血,提示tPA可能在同一條通路上引起缺血后腦出血；rATS和tPA共同給藥發(fā)現(xiàn)rATS可以顯著減少tPA引起的腦出血,而vWF則可以夠逆轉(zhuǎn)rATS對tPA引起腦出血的作用。3.明膠酶譜法分析發(fā)現(xiàn)tPA組相比于vehicle組MMP-9活性上調(diào),rATS能抑制tPA引起的MMP-9活性上調(diào)。4. Western Blot實驗結(jié)果表明rATS+tPA組與tPA組相比,細胞核中NF-kB的水平?jīng)]有顯著性差異。5.Western Blot實驗結(jié)果表明缺血后tPA使VEGF表達明顯上調(diào),rATS能抑制tPA引起的VEGF表達上調(diào)；免疫染色結(jié)果顯示缺血24h后VEGF主要與CD31陽性的血管共定位,tPA組與vehicle組相比,梗死周圍區(qū)域VEGF與CD31免疫共標量顯著增加,rATS+tPA組與tPA組相比共標量下降。6.Western blot分析表明腦缺血能夠激活RhoA, tPA給藥后RhoA的激活量進一步增加,而rATS能夠減少tPA引起的RhoA激活；免疫熒光法計數(shù)梗死24h后缺血周邊區(qū)RhoA-GFAP共標細胞的數(shù)量,rATS+tPA組與tPA組相比RhoA陽性星形膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著減少。結(jié)論：1.腦出血導致血漿vWF表達上調(diào),重組ADAMTS13通過下調(diào)炎癥介質(zhì)、降低MMP-9活性、減少中性粒細胞細胞浸潤和小膠質(zhì)細胞激活從而減少血腦屏障損傷,最終減輕腦損傷和腦水腫。2.tPA通過vWF通路調(diào)節(jié)缺血后腦出血,rADAMTS13通過作用于vWF減少缺血后tPA治療引起的溶栓后腦出血。rADAMTS13通過下調(diào)VEGF表達、減少RhoA激活、抑制MMP-9活性最終減輕tPA引起的缺血溶栓后出血。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R651.15

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