本文關鍵詞：胎肝干細胞治療不同類型F344大鼠急性肝衰竭的實驗研究及大鼠門靜脈分支殘端置管模型構建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《第四軍醫(yī)大學》 2014年

胎肝干細胞治療不同類型F344大鼠急性肝衰竭的實驗研究及大鼠門靜脈分支殘端置管模型構建

劉廣欣  

【摘要】：急性肝衰竭（acute liver failure, ALF）是各種肝臟疾病主要的致死原因之一，以進展迅速的肝性腦病以及嚴重的肝功能損害為特點。肝臟移植被認為是對急性肝衰竭最佳最有效的治療方法，然而供肝的缺乏是嚴重阻礙著肝移植的廣泛開展和應用的瓶頸。細胞移植因其優(yōu)點也成為替代肝移植手術治療急、慢性終末期肝病最有前景的方法[1,2]。胎肝干/祖細胞（FLSPCs）為干細胞治療各種肝病的最理想細胞之一。本實驗利用課題組之前報道的三部分離法在F344胎鼠中有效富集、純化、體外擴增胎肝干細胞，并用pAcGFP1-N1轉染干細胞，使其能表達GFP（green fluorescenceprotein, GFP）作為示蹤。以同種F344大鼠作為實驗對象，利用四氯化碳腹腔注射制造急性藥物性肝衰竭大鼠模型、外科手術方法切除85%大鼠肝臟，制作急性肝損傷肝衰竭大鼠模型。12小時后將轉染后的胎肝干細胞經(jīng)尾靜脈途徑分別注射入上述模型體內(nèi)，分選不同時間段觀察肝臟修復情況。于干細胞移植后12小時后，治療組與對照組肝功能即出現(xiàn)統(tǒng)計學意義，72小時凝血檢查、病死率及肝臟病理切片檢查均顯示治療組優(yōu)于對照組。在驗證胎肝干細胞治療急性肝衰竭的可能性和有效性的基礎上，構建大鼠肝臟斷面門靜脈分支的殘端靜脈置管模型，利用胎肝干細胞經(jīng)過不同的移植途徑驗證新模型的優(yōu)劣。肝功檢查結果表明經(jīng)新模型置管途徑移植細胞治療效果等同于經(jīng)門靜脈穿刺移植治療效果。以此得出結論：1．三步分離法提取的胎肝干細胞具有一定改善急性肝衰竭大鼠的肝功能、凝血及肝臟病理指標的作用。2．經(jīng)門靜脈分支殘端置管途徑移植FLSPCs效果等同于經(jīng)門靜脈穿刺途徑。 目的 1．研究移植胎肝臟原始/干細胞對治療藥物性急性肝功能衰竭及急性損傷性肝衰竭大鼠的可能性與有效性。 2．構建大鼠肝臟斷面門靜脈分支的殘端靜脈置管模型，并在實驗一的基礎上進行不同途徑的胎肝干細胞細胞移植實驗，，以此來對比分析新模型的優(yōu)劣。方法 1．胎肝干細胞的富集、純化和轉染示蹤 于胎齡14d的F344孕鼠中提取胎肝，經(jīng)酶消化后，利用三步分離法進行FLSPCs的提取、純化、體外擴增。并用pAcGFP1-N1轉染干細胞，使其能表達GFP作為示蹤。 2．急性肝衰竭動物模型的構建、干細胞的植入以及測定移植修復的指標 將80只F344大鼠分為四組。A、B組按3ml/kg予腹腔一次性注射四氯化碳(CCl4)溶液，C、D兩組行肝臟85%切除，12小時后予以B、D兩治療組尾靜脈注射1×106個胎肝干細胞，A、C兩對照組注射等劑量培養(yǎng)液，在不同時間段提取四組大鼠血清，測定肝功能ALT、AST、TBIL、ALB，及凝血指標PT，統(tǒng)計死亡率、腹水生成量；取肝臟組織切片觀察其修復情況。 3．構建大鼠肝斷面門靜脈分支殘端的靜脈置管模型，并進行胎肝干細胞的細胞移植實驗，進行肝臟修復指標測試以對比分析新模型的優(yōu)劣。 60只F344大鼠分為三組。E、F組行行85%肝切除術；G組行85%肝切除術+肝斷面門靜脈分支殘端置管術。術中F組經(jīng)門靜脈注入4×105個表達GFP（greenfluorescence protein, GFP）的胎肝干細胞（fetal liver stem/progenitor cells, FLSPCs）。G組經(jīng)留置導管注射入同等量的FLSPCs，E組注射同等劑量的培養(yǎng)液。72小時取血清，測定肝功能ALT、AST，統(tǒng)計死亡率；取肝臟組織切片觀察其修復情況。統(tǒng)計學采用方差分析和LSD-t檢驗。 結果 1．三步分離法能有效從14d胎齡的F344孕鼠胚胎肝臟中富集FLSCs。細胞增殖速度快、貼壁快，細胞長滿后呈鋪路石樣外觀。細胞體積小、大小、形態(tài)均勻一致，多呈三角形或多角形，核漿比例較大。 2．在移植胎肝干細胞后12小時后，兩模型組內(nèi)的肝功能指標檢測（ALT、AST、TBIL、ALB)即開始出現(xiàn)統(tǒng)計學差異（P0.05）。A組ALT、AST、TBIL、ALB均值分別為(5404.17±376.94)U/L、(6823±348.99)U/L、(98.43±5.21)umol/L、(24.12±1.21)g/；B組為：(4807±244.62)U/L、(5290.67±289.68)U/L、(83.67±3.501)umol/L、(26.33±1.21)g/L； C組分別為：(1946.3±106.87)U/L、(3834.5±230.05)U//L、(102.50±8.24)umol/L、(17.83±1.72)g/L； D組分別為：(1400.5±124.07)U/L、(2985±134.07)U/L、(83±7.61)umol/L、(21.33±1.86)g/L。在移植后36小時、60小時檢測肝功，隨時間推移B、D組肝功指標恢復改善明顯優(yōu)于相應對照組。60小時測PT值及腹水均分別優(yōu)于兩對照組（P0.01）；干細胞移植后60小時后取出肝臟行冰凍切片檢查： A組損傷重、結構破壞明顯，大面積肝細胞壞死，肝小葉破壞；B組較對照組明顯減輕；C組肝細胞增生不明顯，伴有炎細胞浸潤；D組見肝細胞增生廣泛，肝小葉結構恢復明顯。 3．表達GFP示蹤的胎肝干細胞經(jīng)模型留置管道移植及經(jīng)門靜脈穿刺移植后72小時檢測肝功能數(shù)據(jù)顯示F組ALT、 AST分別為(802.83±79.22)U/L、(1463.50±56.22)U/L; G組ALT、AST分別為(827.83±63.08)U/L、(1472.83±52.41)U/L；E組ALT （1275.67±329.59)U/L、(2806.83±157.0)U/L。F組G組兩者間無明顯統(tǒng)計學差異，但均優(yōu)于對照組。兩者病理學檢查均提示肝臟體積較對照組有所增大，肝葉代償，鏡下見肝細胞增生明顯，肝索結構較完整，肝小葉結構較E組有較明顯恢復。E組病理學顯示剩余肝葉代償性腫大。鏡下可見肝竇及中央靜脈擴張，伴有炎細胞浸潤，肝細胞增生不明顯。提示經(jīng)門靜脈分支殘端置管途徑移植FLSPCs治療急性肝損傷性肝衰竭效果等同于經(jīng)門靜脈穿刺途徑。 結論 1．三步分離法提取的胎肝干細胞具有一定改善急性肝衰竭大鼠的肝功能、凝血及肝臟病理指標的作用。 2．經(jīng)門靜脈分支殘端置管途徑移植FLSPCs效果等同于經(jīng)門靜脈穿刺途徑，且該模型具有可反復、可選時、減少創(chuàng)傷等優(yōu)點。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R575.3
【目錄】：

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本文編號：149519