本文關(guān)鍵詞： 膿毒癥 LPS 急性腎損傷 腎小管上皮細胞 巨噬細胞 NFκB　出處：《安徽醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：一、研究背景膿毒癥(sepsis)的發(fā)病機制是機體一種失控的全身性炎癥反應(yīng),是一種復(fù)雜的臨床綜合征,表現(xiàn)為各種炎癥介質(zhì)的過度釋放,引起廣泛的細胞和組織損傷,進一步可導(dǎo)致膿毒性休克、嚴重膿毒癥甚至多器官功能障礙綜合征。而腎臟是膿毒癥發(fā)生和發(fā)展過程中最易受到損傷的器官,急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)是最常見的并發(fā)癥之一,是死亡的獨立危險因素。近年來的研究進一步認識了膿毒癥AKI的發(fā)生機制包括:腎微循環(huán)障礙導(dǎo)致腎臟灌注不足,腎小球周的毛細血管網(wǎng)循環(huán)失調(diào),炎癥標志物與氧化應(yīng)激增加對腎小管的毒性作用,級聯(lián)反應(yīng)的激活和器官高代謝反應(yīng)至致細胞死亡等。在這些發(fā)病機制中,級聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)在膿毒癥AKI中起著舉足輕重的作用。Tec(Tyrosine kinase expressed in hepatocelluar carcinoma)是最早研究肝癌時發(fā)現(xiàn)的一種酪氨酸蛋白激酶基因表達產(chǎn)物,Tec家族和其他兩個主要的酪氨酸蛋白激酶家族(Src、Syk激酶家族)被證實與炎癥反應(yīng)相關(guān)。Tec激酶家族的Tec、Src被證實在炎癥反應(yīng)中的早期即有激活并磷酸化,其活化亦可能與TLR早期活化相關(guān),對Tec激酶家族的干預(yù)試驗已被用于一些自身炎癥性疾病如類風濕性關(guān)節(jié)炎等。Tec激酶在膿毒癥所致的全身炎癥反應(yīng)中所發(fā)揮的機制目前研究甚少,一些研究認為Tec非受體型激酶參與了感染導(dǎo)致膿毒癥的過程,并且認為干預(yù)Tec激酶的治療可能是改善感染所致膿毒癥的新的靶點。在膿毒癥AKI的發(fā)生和發(fā)展過程中,Tec激酶的表達情況以及Tec激酶是否參與膿毒癥AKI的發(fā)生及其可能的機制,目前罕有文獻報道。本研究部分旨在制造膿毒癥急性腎損傷模型,并且了解Tec激酶的腎內(nèi)表達情況,初步探討Tec激酶是否參與膿毒癥AKI的過程及其可能機制。二、研究目的1.在體內(nèi)實驗中,通過LPS誘導(dǎo)膿毒癥AKI模型的建立,研究Tec激酶在AKI腎組織中的表達變化,采用Tec激酶抑制劑進一步研究對AKI腎功能的影響以驗證其與AKI發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。同時了解不同組別之間腎組織TLR4、MYD88的表達、NF-κB通路活化情況及腎間質(zhì)巨噬細胞浸潤來探討Tec激酶在AKI的可能作用機制。2.體外實驗中觀察Tec激酶在LPS刺激誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞釋放炎癥因子的影響;并通過使用Tec激酶抑制劑和其si RNA后了解其對炎癥介質(zhì)的分泌和MAPK和NF-κB通路活化的影響,期望通過上述研究進一步認識Tec激酶在膿毒癥AKI的發(fā)生發(fā)展中的可能機制,為AKI的治療提供新的靶點。三、研究內(nèi)容第一部分膿毒癥小鼠AKI中Tec激酶蛋白的表達變化健康雄性清潔級成年C57BL/6小鼠32只,分2組,每組16只,LPS組給予LPS腹腔注射20mg/kg,正常對照組給予等量溶媒,分別于1h、6h、24h、48h每組4只小鼠,麻醉后心臟取血查血清IL-1β、TNF-ɑ及腎功能(肌酐、尿素氮、胱抑素C)并分離腎臟組織,病理學HE染色觀察組織結(jié)構(gòu),免疫組化觀察Tec激酶表達,Western blot觀察Tec激酶、TLR4、NFκB-p65、p-NFκB-p65蛋白表達變化。第二部分Tec激酶蛋白抑制劑LFM-A13對膿毒癥小鼠AKI的保護作用健康雄性清潔級成年C57BL/6小鼠36只,分6組,每組6只,LPS組給予LPS腹腔注射20mg/kg,正常對照組給予等量溶媒,LPS+LFM-A13(40mg/kg)、LPS+LFM-A13(60mg/kg)、LPS+LFM-A13(80mg/kg)組分別在給予LPS20mg/kg腹腔注射后立即并分次給予LFM-A13(40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg)腹腔給藥,LFM-A13組僅給予LFM-A13(60mg/kg)腹腔給藥,并補足小鼠腹腔灌注液體體積為1ml/20g,造模后24小時,小鼠麻醉后心臟取血查血清IL-1β、TNF-ɑ及腎功能(肌酐、尿素氮、胱抑素C)并分離腎臟組織,病理學HE染色觀察組織結(jié)構(gòu),免疫組化觀察Tec激酶表達,巨噬細胞浸潤,Western blot觀察Tec激酶、myd88、TLR4、NFκB-p65、p-NFκB-p65蛋白表達變化。培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細胞系NRK-52E,分別以不同濃度的LPS(0ug/ml、0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml)刺激,再以0.1ug/ml LPS刺激NRK-52E細胞不同時間(0min、15m、30min、60min、120min),提取細胞蛋白,Western blot檢測Tec激酶表達狀況。再觀察抑制劑的體外效果,LPS(0.1ug/ml)并加用不同濃度LFM-A13(50u M、75u M、100u M)預(yù)處理1h,提取細胞蛋白,Western blot檢測Tec激酶表達狀況。第三部分抑制Tec激酶蛋白表達對LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞促炎性細胞因子產(chǎn)生的影響及機制培養(yǎng)巨噬細胞RAW264.7,加用抑制劑LFM-A13(25u M、75u M)預(yù)處理RAW264.7細胞1h,并0.1ug/ml LPS刺激1h,流式細胞術(shù)、q RT-PCR的方法檢測RAW264.7細胞上ICAM-1的表達水平,提取細胞蛋白,western blot檢測IκBα、NFκB-p65的蛋白表達及磷酸化水平及TAK-1的磷酸化水平,激光共聚焦檢測RAW264.7細胞中NFκB-p65核轉(zhuǎn)移狀況。Tec激酶si RNA干擾RAW264.7細胞特異性沉默Tec激酶基因表達,并在瞬時轉(zhuǎn)染后給予LPS0.1mg/ml刺激RAW264.7細胞1h,提取細胞蛋白,western blot檢測TAK1、p-p38/p38和p-p65蛋白表達。四、研究結(jié)果第一部分建立小鼠LPS腹腔注射致膿毒癥AKI模型,LPS20mg/kg腹腔內(nèi)注射后1h即可見腎臟組織的輕度損傷及Cys C升高,6h可見血尿素氮升高,24h腎功能指標均有明顯升高,并可見明顯的腎臟組織學損害。48h上述腎功能及腎臟組織損傷明顯改善。造模后1h即可見血清炎癥因子IL-1β和TNF-ɑ明顯升高,其中IL-1β在6h時升高最為明顯,TNF-ɑ在1h時升高最為明顯。造模后1h即可見腎內(nèi)Tec激酶及TLR4蛋白表達升高,持續(xù)致6h后開始下降,與正常對照組相比持續(xù)至48h均有升高。造模后6h可見NFκB-p65及其磷酸化水平明顯升高。腎組織免疫組化證實在LPS致膿毒癥建模后1h即可見腎小管上皮細胞內(nèi)Tec激酶表達升高。第二部分小鼠腹腔注射LPS 24h后腎功能(肌酐、尿素氮、胱抑素C)明顯升高,腎組織損傷明顯,抑制劑LFM-A13給藥后各個劑量組均能明顯改善小鼠腎功能變化,同時明顯改善腎臟組織病理損傷。血清ELISA檢測提示LFM-A13明顯降低膿毒癥模型組IL-1β及TNF-ɑ水平。western blot結(jié)果提示LFM-A13明顯減少膿毒癥小鼠腎臟組織Tec激酶、MYD88、TLR4、NFκB-p65、p-NFκB-p65蛋白表達水平。免疫組化染色提示LFM-A13明顯減少腎小管上皮細胞內(nèi)Tec激酶的表達,并明顯減少膿毒癥小鼠腎內(nèi)巨噬細胞浸潤。體外實驗示濃度梯度LPS刺激大鼠腎小管上皮細胞系NRK-52E,0.1mg/ml即可見Tec激酶蛋白表達升高。時間效應(yīng)觀察0.1ug/ml LPS刺激大鼠腎小管上皮細胞后30min即可見Tec激酶表達的升高,持續(xù)升高致120min,抑制劑LFM-A13(50u M、75u M、100u M)可以明顯減少Tec激酶的表達。第三部分流式細胞術(shù)、q RT-PCR顯示LFM-A13減少LPS刺激后RAW264.7細胞ICAM-1的產(chǎn)生。Western blot示LFM-A13(25u M、75u M)下調(diào)LPS刺激RAW264.7細胞后NFκB-p65及TAK1的活化;LPS刺激促進了RAW264.7細胞胞漿內(nèi)IκBα蛋白的磷酸化降解和NFκB-p65的核轉(zhuǎn)移,進而激活NFκB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,而Tec激酶抑制劑LFM-A13預(yù)處理則明顯能抑制NFκB信號通路的活化,并明顯減少NFκB-p65的核轉(zhuǎn)移。Tec si RNA(Tec mus-790 RNAi)選擇性沉默Tec激酶m RNA表達后可明顯下調(diào)LPS刺激RAW264.7細胞內(nèi)p-p38/p38、p-p65、p-TAK1/TAK1蛋白的表達水平。五、研究結(jié)論1.采用LPS(20mg/kg)腹腔內(nèi)注射后1h即可檢測出炎癥指標的明顯升高,并出現(xiàn)早期腎功能損傷,以24小時最為明顯,其后呈現(xiàn)修復(fù)趨勢。膿毒癥AKI小鼠腎臟組織極早期便可檢測出Tec激酶的高表達,并伴隨TLR4通路蛋白及下游細胞因子NFκB-p65的表達及活化水平的升高,提示Tec激酶參與了膿毒癥AKI的早期啟動過程,并可能通過參與膿毒癥致炎癥損傷機制而發(fā)揮作用。2.LPS刺激的小鼠膿毒癥模型其腎臟組織中存在Tec激酶蛋白的過高表達,并在腎小管上皮細胞中存在過高表達。LFM-A13在體內(nèi)及體外均能夠抑制腎小管上皮細胞中Tec激酶蛋白過高表達,并可能通過抑制TLR4/MYD88信號通路,抑制NFκB-p65的活化,減少炎癥因子產(chǎn)生及巨噬細胞浸潤等機制發(fā)揮防治AKI的作用,改善腎功能損傷及腎臟組織病理損傷。3.LFM-A13預(yù)處理RAW264.7細胞以及si RNA沉默Tec激酶基因表達后,可抑制LPS刺激的Tec激酶過高表達,并可能通過抑制TAK1通路干擾NFκB信號通路的活化并減少炎癥因子的釋放,從而發(fā)揮其在巨噬細胞中的抗炎作用。
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【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R459.7

【參考文獻】

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本文編號：1481698