本文關(guān)鍵詞：Sphk1對(duì)缺血性腦損傷的雙重作用

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【摘要】：目的：研究鞘氨醇激酶1（Sphingosine kinase1，Sphk1）對(duì)缺血性腦損傷的作用機(jī)制。 方法：通過線栓堵塞小鼠大腦中動(dòng)脈的方法建立缺血性腦損傷再灌注動(dòng)物模型(MCAO)。使用實(shí)時(shí)定量PCR（Quantitative real-time PCR，RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)小鼠腦缺血再灌后皮層Sphk1、Sphk2和炎癥因子的mRNA水平。通過免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)Sphk1蛋白在皮層缺血半暗帶的表達(dá)情況。利用免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence staining）觀察在腦缺血皮層表達(dá)Sphk1的細(xì)胞類型。將小鼠在缺血再灌注后隨機(jī)分成溶劑組(Vehicle)和Sphk1的抑制劑5C組，并于再灌注后3h，12h，24h，48h和72h分別給予溶劑或5C（2mg/kg），以1%2,3,5-tripheyltetrazolium chloride（TTC）染色的方法檢測(cè)小鼠在MCAO后24h和96h的腦梗死體積。使用Z-Longa評(píng)分方法觀察Sphk1抑制劑對(duì)MCAO后96h神經(jīng)功能的影響。使用側(cè)腦室注射small-interfering RNA(siRNA)的方法分別特異性地抑制MCAO后Sphk1，Sphk2和TRAF-2的基因在缺血腦皮層的表達(dá)，以TTC染色法探討Sphk1、Sphk2和TRAF-2對(duì)腦梗死體積的影響；通過檢測(cè)Evans Blue外滲情況及腦內(nèi)血紅蛋白的含量檢測(cè)Sphk1對(duì)MCAO后血腦屏障完整性的作用；以免疫共沉淀法（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）研究MCAO后腦缺血皮層中Sphk1和TRAF-2的作用。 結(jié)果：在小鼠MCAO模型中，鞘氨醇激酶1（Sphk1）在腦缺血的病理過程中發(fā)揮雙重作用。RT-PCR結(jié)果顯示：與對(duì)側(cè)的皮層相比，，在小鼠的腦皮層缺血半暗帶區(qū)Sphk1mRNA被誘導(dǎo)表達(dá)，而腦缺血后Sphk2mRNA的水平卻沒有發(fā)生變化；Western blotting顯示：在MCAO的動(dòng)物模型中，小鼠腦皮層缺血半暗帶區(qū)Sphk1的蛋白也較對(duì)側(cè)明顯升高。免疫熒光法顯示：Sphk1高表達(dá)于缺血側(cè)皮層的半暗帶區(qū)域，而且Sphk1主要與小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記共定位。TTC染色和Z-Longa神經(jīng)功能評(píng)分的結(jié)果顯示：Sphk1抑制劑5C、Sphk1siRNA和TRAF-2siRNA能顯著降低腦缺血再灌注后的梗死體積，5C能顯著提高M(jìn)CAO后96h的神經(jīng)功能評(píng)分。Sphk1抑制劑5C和Sphk1siRNA能顯著抑制腦缺血導(dǎo)致的炎癥因子IL-1β、iNOS、MMP9和TNF-α mRNA在缺血皮層的誘導(dǎo)表達(dá)。Evans Blue結(jié)果顯示：Sphk1siRNA增加腦缺血后Evans Blue在腦內(nèi)的滲出量；血紅蛋白檢測(cè)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)：Sphk1siRNA增加了MCAO后腦內(nèi)血紅蛋白的含量。Co-IP的結(jié)果表明在皮層缺血半暗帶Sphk1和TRAF-2相互結(jié)合在一起。 結(jié)論：小鼠MCAO后，在皮層缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞中Sphk1被誘導(dǎo)表達(dá)，抑制Sphk1能降低腦梗死體積和缺血后神經(jīng)炎癥應(yīng)答，并改善神經(jīng)功能，但加劇血腦屏障的損傷和腦出血的風(fēng)險(xiǎn)。我們的研究表明Sphk1對(duì)缺血性腦損傷具有雙重作用，可能是腦缺血治療的新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R651.15

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本文編號(hào)：1294895