本文關(guān)鍵詞：基于抗原組學(xué)技術(shù)篩選與鑒定尖吻蝮蛇蛇毒保護(hù)性抗原

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【摘要】：蛇類在地球上有著廣泛的分布，目前已被發(fā)現(xiàn)的蛇類多達(dá)3000多種，其中只有15%的蛇類是具有毒性的，對(duì)人類健康造成威脅。毒蛇咬傷主要發(fā)生在熱帶和亞熱帶農(nóng)村地區(qū)，特別是低收入國家農(nóng)村地區(qū)，因此許多毒蛇咬傷病例未予報(bào)告，造成流行病學(xué)資料缺失，蛇傷的具體發(fā)病情況難以得到正確統(tǒng)計(jì)。據(jù)報(bào)道，全球每年大約有2500000蛇咬傷病例發(fā)生，大約有125000人因毒蛇咬傷死亡。在2009年，世界衛(wèi)生組織（WHO）首次承認(rèn)，蛇咬傷是一個(gè)被長(zhǎng)期忽視的公眾健康問題。 尖吻蝮蛇是我國特有的蛇種，主要分布在中國南方地區(qū)，其分泌的毒液中含有多種毒素成分，目前研究較多的毒素成分是金屬蛋白酶（Metalloproteinase）、磷酯酶A2（PhospholipaseA2）、絲氨酸蛋白酶（Serine proteases）、C型凝集素（C-type lectin-likeprotein）。尖吻蝮蛇蛇毒具有很強(qiáng)的血液毒性，中毒后常造成全身系統(tǒng)性的出血，局部組織壞死，給臨床治療帶來困難。 噬菌體展示肽庫技術(shù)是近幾年來發(fā)展起來的，用于模擬抗原研究的新技術(shù)，這一技術(shù)現(xiàn)已成功的運(yùn)用于模擬抗原篩選，并能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其基本原理是：在噬菌體表面插入各種組合的氨基酸短肽，通過抗原抗體識(shí)別反應(yīng)，使含有特定蛋白的噬菌體，從肽庫中篩選出來，通過測(cè)序獲得特定蛋白的結(jié)構(gòu)和功能信息�，F(xiàn)這一技術(shù)在確定抗原表位、篩選小分子模擬肽、疫苗開發(fā)、分子診斷等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。 研究目的：利用尖吻蝮蛇蛇毒免疫新西蘭兔，通過實(shí)驗(yàn)純化制備特異性尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多克隆抗體的生物活性；在純化尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體的基礎(chǔ)上，利用噬菌體展示肽庫技術(shù)，篩選與鑒定尖吻蝮蛇蛇毒保護(hù)性抗原，并采用基因工程技術(shù)，合成、表達(dá)重組抗原肽，對(duì)重組抗原肽免疫保護(hù)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估,從而為新型抗蛇毒血清的研究奠定基礎(chǔ)。 研究?jī)?nèi)容和方法： 第一部分：以尖吻蝮蛇蛇毒免疫新西蘭兔，并利用Econo-Pac ProteinAkit及CNBractivated sepharose4B凝膠對(duì)兔源性抗蛇毒抗體進(jìn)行純化，制備特異性尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體，，用Western blot和ELISA對(duì)抗體進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過出血抑制實(shí)驗(yàn)及致死性保護(hù)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)抗體的生物活性。 第二部分：以抗尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體為靶蛋白，對(duì)噬菌體隨機(jī)肽庫進(jìn)行三輪生物淘選，獲得與抗體特異性結(jié)合噬菌體陽性克隆，通過ELISA法和Western blot測(cè)定噬菌體單克隆與抗體的結(jié)合力，進(jìn)一步篩選陽性克隆，對(duì)候選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，得到插入短肽氨基酸序列，利用基因工程技術(shù)，對(duì)篩選獲得的抗原片斷進(jìn)行串聯(lián)重組表達(dá)，獲得重組抗原肽，將重組抗原肽免疫BALB/C小鼠，并通過出血抑制實(shí)驗(yàn)，評(píng)估重組抗原肽的免疫保護(hù)效果。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1）成功地制備了抗尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體，通過ELISA法檢測(cè)，抗蛇毒抗體滴度＞1:3200；Western blot分析示：多克隆抗體與蛇毒中大多數(shù)毒素蛋白結(jié)合；體外出血抑制試驗(yàn)顯示該抗體能有效地抑制尖吻蝮蛇蛇毒所導(dǎo)致的皮內(nèi)出血；在致死性保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，多克隆抗體對(duì)2LD50和4LD50蛇毒分別起到100%和54%的保護(hù)作用。 2）在本研究中，利用噬菌體展示肽庫技術(shù)篩選出5個(gè)抗原表位，將該部分抗原進(jìn)行串聯(lián)重組表達(dá)，獲得重組抗原肽，通過ELISA實(shí)驗(yàn)證明，重組抗原肽能有效的刺激小鼠產(chǎn)生抗體，該抗體能與重組抗原肽結(jié)合，也能被蛇毒抗原識(shí)別，與重組抗原肽識(shí)別滴度達(dá)到1:64000，與蛇毒識(shí)別滴度達(dá)到1:8000。在體外出血中和試驗(yàn)中，重組抗原肽免疫小鼠血清能100%抑制2MHD尖吻蝮蛇蛇毒所致的皮內(nèi)出血，能減少82%的由4MHD蛇毒所致的皮內(nèi)出血面積。 結(jié)論本研究通過噬菌體展示肽技術(shù)，篩選與鑒定出5個(gè)抗原表位，這些抗原表位具有較好的免疫保護(hù)性，從而為新型抗蛇毒血清的研究與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：尖吻蝮蛇 多克隆抗體 噬菌體肽庫 抗蛇毒血清
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R646
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• Abstract6-9
• 摘要9-11
• 第一章 前言11-16
• 第二章 尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體純化及生物活性研究16-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑16-18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法18-27
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-31
• 2.4 討論31-34
• 第三章 隨機(jī)肽庫技術(shù)篩選與鑒定尖吻蝮蛇保護(hù)性抗原34-53
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑34-36
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法36-43
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-50
• 3.4 討論50-53
• 全文總結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 附件58-66
• 文獻(xiàn)綜述66-79
• 參考文獻(xiàn)74-79
• 攻讀碩士期間發(fā)表文章目錄79-80
• 致謝80

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 周亞麗;勞興珍;袁玲;柳萌;鄭珩;;免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的研究進(jìn)展[J];藥物生物技術(shù);2012年03期

2 黃春洪;孔毅;吳杰連;劉睿;吳梧桐;;尖吻蝮蛇毒素組雙向電泳和二維液相色譜研究[J];中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào);2006年02期

3 牛立文;滕脈坤;朱中良;高永翔;張平;;若干蛇毒蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究[J];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)學(xué)報(bào);2008年08期

本文編號(hào)：1095766